Matériel et méthodes

2.4.1. Souches bactériennes et conditions de croissance

La MccJ25 a été produite par la souche E. coli K-12 MC4100 possédant le plasmide pTUC202 (Laboratoire de chimie et de biochimie des substances naturelles, Museum national d’histoire naturelle, Paris, France) portant le système génétique de biosynthèse du peptide antimicrobien et conférant une résistance au chloramphénicol (Cm). La souche a été cultivée dans un bouillon de culture Luria-Bertani (LB Broth, Miller (Luria-Bertani); BD Difco, Sparks, MD, USA) contenant 34 μg/mL de chloramphenicol incubé à 37°C en aérobie avec repiquage aux 24 h. Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis (Museum National d’Histoire Naturelle, Paris) a été utilisée comme souche sensible à la MccJ25 lors des tests d’activité antibactérienne. Salmonella a été cultivée dans un bouillon de culture Luria-Bertani (Difco) sans Cm incubé à 37°C en aérobie avec repiquage aux 24 h. Les souches ont été préalablement repiquées 3 fois (1 %, v/v) avant leur utilisation.

2.4.2. Production de la MccJ25

La souche E. coli K-12 MC4100 pTUC202, cultivée préalablement dans du milieu LB, a servi à inoculer à 2 % 1,5 L de milieu M63. Le milieu M63 (Miller, 1972) est un milieu minimum composé de KH2PO4 ((3 g/L),

K2HPO4 (3 g/L), (NH4)2PO4 (2 g/L), acides casaminiques (1g/L), solution de MgSO4 filtrée (20 %), solution de

glucose filtrée (20 %), solution de thiamine filtrée (1 g/L). La culture a été incubée une nuit à 37°C sous une agitation de 150 rpm. La culture a été ensuite centrifugée à 8 000 g pendant 20 minutes à 4°C. Le surnageant contenant la MccJ25 a été récupéré.

2.4.3. Purification de la MccJ25

La MccJ25 a été extraite du surnageant de la culture en M63 de E. coli MC4100 pTUC 202 selon la méthode de Blond et al. du Laboratoire de chimie et de biochimie des substances naturelles du Museum national d’histoire naturelle de Paris (Blond et al., 1999). Brièvement, le surnageant a été appliqué à une cartouche de phase inverse C18 (Sep-Pak C18 35 cc, Waters) auparavant conditionnée avec 200 mL de méthanol, 200 mL d’acétonitrile pure (ACN) et enfin 200 mL d’H2O ultra-pure additionnée de 0,1 % d’acide formique (CH2O2).

Après chargement du surnageant, la cartouche a été rincée avec 200 mL d’H2O/0,1 % CH2O2, puis l’élution de

la MccJ25 a été réalisée en faisant varier de 10 % à 40 % la teneur en ACN de la phase mobile (H20/0,1 %

CH2O2/ACN). Les éluats ont été récupérés. La colonne a été lavée à l’ACN pure (100 %). L’ACN de l’éluat à

30 % d’ACN, celui contenant la MccJ25 (fraction active), a été évaporé en utilisant un évaporateur rotatif sous vide à 120 rpm dont le bain était réglé à 40°C. La fraction récupérée ne contenant plus d’ACN a été lyophilisée, puis solubilisée dans de l’eau ultra-pure. Elle a ensuite été analysée de façon préparative par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC, Beckman Coulter System Gold Preparative HPLC system) sur une colonne C18, 5 μm, 250 x 4,6 mm (Luna, Phenomenex) avec comme éluant un mélange filtré d’eau ultra-pure/0,1 % CH2O2 et d’ACN/0,1 % CH2O2, un débit de 10 mL/min et une

absorbance mesurée à 214 nm. La fraction correspondant au pic de la MccJ25 identifié par comparaison avec le chromatogramme du peptide pur (pic à 47,69 % d’ACN, Amp : 1,8 AU, 18 minutes) a été récupérée. Elle a subi une seconde étape de purification par RP-HPLC, puis l’échantillon a été lyophilisé, solubilisé dans de l’eau ultra-pure et enfin stocké à -20°C.

2.4.4. Détermination de la concentration protéique

À chaque étape de purification, la concentration de MccJ25 de l’échantillon a été déterminée par la méthode de Lowry (Lowry, Rosebrough, Farr, & Randall, 1951). La MccJ25 a également été quantifiée par

chromatographie liquide haute performance de façon analytique (Agilent HP 1100 HPLC system). Il a fallu préalablement établir une courbe standard de la MccJ25 par HPLC. Des quantités connues de MccJ25, 100 μg, 50 μg, 20 μg, 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,1 μg, 0,05 μg et 0,025 μg, ont été injectées à l’HPLC, puis lues à une absorbance de 280 nm et de 230 nm. Le gradient a été mis au point comme suit : 0 % solvant B, 100 % solvant A à 50 % solvant A et 50 % solvant B avec un débit de 1mL/min, le solvant B étant de l’eau ultra-pure/0,1 % CH2O2 et le solvant B de l’ACN/0,1 % CH2O2. L’aire du pic pour chaque quantité de

MccJ25 a été calculée par intégration. Ceci a permis de tracer la courbe étalon de l’aire des pics en fonction des quantités de MccJ25. Une fois la courbe standard obtenue, les échantillons en sortie des différentes étapes de purification de la MccJ25 ont été injectés à leur tour dans l’HPLC. Le gradient utilisé fut le même que celui utilisé pour l’obtention de la courbe standard. L’aire de chaque pic de MccJ25 a été relevée. En se servant de l’équation de la courbe standard qui est une relation y = ax + b, il a ainsi été possible de quantifier la MccJ25 produite et purifiée.

2.4.5. Évaluation de l’activité antimicrobienne

À chaque étape de purification, l’activité antimicrobienne de l’échantillon, auparavant filtré avec un filtre à seringue en acétate de cellulose ayant un seuil de rétention de 0,2 μm (VWR, Mississauga, ON, Canada), a été testée par deux méthodes : la méthode par diffusion en gélose (Wolf & Gibbons, 1996) et la méthode par microtitration (Daba, Lacroix, Huang, Simard, & Lemieux, 1994).

2.4.5.1. Méthode de diffusion en gélose

Brièvement, la température d’un milieu LB supplémenté de 0,75 % (w/v) d’agar a été abaissée à 47°C, puis la gélose a été inoculée à 1 % (v/v) d’une culture overnight de la souche cible, Salmonella enteritidis, et coulée (25 mL) à température pièce dans une boîte de Pétri stérile. Une fois la gélose solidifiée, des puits de 7 mm de diamètre ont été creusés dans la gélose avec la partie non-effilée d’une pipette sérologique de 5 mL en verre. Les puits ont été remplis de 80 μL de l’échantillon à tester, puis les boîtes de Pétri ont été incubées 18 h à 37°C en aérobie. Le lendemain, les diamètres d’inhibition ont été mesurés.

2.4.5.2. Méthode de microtitration

Une dilution au demi en série d’une concentration connue de l’échantillon à tester a été réalisée dans les puits d’une microplaque en polystyrène de 96 puits (Becton, Dickinson & Company, USA) contenant un milieu de culture LB. Chaque puits a été inoculé d’une culture overnight de Salmonella enteritidis diluée à 1/1000 pour

obtenir une concentration de 5.104 _{UFC/mL. La microplaque a été incubée 18 h à 37°C en aérobie, puis la}

densité optique a été mesurée à 595nm avec un spectrophotomètre (Molecular Devices ThermoMax Microplate Reader, OPTI-Resources, Québec, QC, Canada). En connaissant la concentration initiale de l’échantillon testé (celle du premier puits avant dilutions), il a été possible de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) correspondant à la plus faible concentration de bactériocine pour laquelle une inhibition totale de la souche cible est observée (son absorbance est semblable à celle d’un milieu non- inoculé). L’activité en AU/mL a été calculée par la formule 2n_{(1000/125) où 2 est le facteur de dilution, n le}

nombre de puits d’inhibition (où aucune croissance visible) et 125 le volume en μl de substance testée.