Marqueurs m‘taboliques

Ces marqueurs consistent à d‘terminer d'une part les besoins ‘nerg‘tiques et ‘l‘mentaires des bact‘ries et d'autre part à mettre en ‘vidence certaines enzymes ou voies m‘taboliques. Les m‘thodes consistent à :

 D‘montrer que la souche est capable de cro”tre en pr‘sence de tel ou tel substrat comme unique source de carbone et d'‘nergie (auxanogramme)

 D‘montrer que la souche est capable d'utiliser un substrat dans certaines conditions culturales (‘tude de la voie d'attaque de sucres)

 Rechercher dans une culture le produit final d'un ensemble de r‘actions m‘taboliques (acides organiques, hydrogène sulfur‘, indole, ac‘toïne, cadav‘rine, etc.) ou la disparition d'un substrat (g‘latine).

Etude du m‘tabolisme ‘nerg‘tique :La plupart des bact‘ries rencontr‘es en m‘decine tirent leur ‘nergie de l'oxydation de substances ‘nerg‘tiques (bact‘ries chimio-organotrophes). Ces r‘actions d'oxydation n‘cessitent donc des substrats ‘nerg‘tiques donneurs d'‘lectrons (le plus souvent des sucres, utilis‘s simultan‘ment comme source de carbone) et des accepteurs finaux d'‘lectrons.

L'auxanogramme permet de reconna”tre les divers substrats ‘nerg‘tiques utilisables. La souche est ensemenc‘e dans un milieu auquel le substrat ‘tudi‘ est ajout‘. ≥ne croissance indique l'utilisation du substrat.

Le catabolisme du glucose, pris comme exemple de substrat ‘nerg‘tique, abouti à la formation d'ATP, d'acide pyruvique et de coenzymes r‘duits qui peuvent ’tre r‘oxyd‘s par 2 voies :

La voie fermentative dans laquelle les coenzymes r‘duisent l'acide pyruvique en divers produits de fermentation (alcools, ald‘hydes, acides carboxyliques, c‘tones, lactate, etc.). On dira alors que le glucose est ferment‘, ou utilis‘ par la voie fermentative. Cette voie fonctionne en l'absence d'oxygène (ana‘robiose).

La voie oxydative ou respiratoiredans laquelle l'acide pyruvique est d‘grad‘ dans le cycle de Krebs et les coenzymes se r‘oxydent avec production d'A≤P en transf‘rant leurs ‘lectrons et

Cet accepteur peut ’tre l'oxygène, le système ne fonctionne alors qu'en a‘robiose (respiration a‘robie)

Cet accepteur peut ’tre une autre substance (nitrate, sulfate, acide organique, etc.) et le système fonctionne alors en ana‘robiose (respiration ana‘robie). On dit que la bact‘rie "respire les nitrates" (ou les sulfates, etc.) en ana‘robiose.

L'‘tude des voies d'attaque du glucose (ou d'un autre sucre) consiste à ‘tudier la croissance de la bact‘rie dans un milieu pauvre, faiblement g‘los‘ et suppl‘ment‘ en glucose (Milieu d'Etude de la Voie d'Attaque des Glucides ou MEVAG). Ce milieu est d‘soxyg‘n‘ par chauffage, ensemenc‘ puis incub‘ en a‘robiose d'une part et en ana‘robiose d'autre part. L'attaque fermentative du glucose se traduit par une acidification du milieu incub‘ en ana‘robiose (accumulation d'acides de fermentation). L'attaque oxydative se traduit par une absence d'acidification dans le milieu ana‘robie et une croissance avec ou sans acidification dans la zone a‘robie du milieu incub‘ en a‘robiose.

L'utilisation des nitrates comme accepteurs d'‘lectrons (respiration des nitrates) peut ’tre recherch‘e par une bact‘rie non fermentante. Il suffit de cultiver cette bact‘rie (normalement a‘robie stricte) en ana‘robiose (g‘lose profonde) en pr‘sence de glucose (substrat ‘nerg‘tique) et de nitrate (accepteur d'‘lectron). En cas de respiration des nitrates une culture s'observe en ana‘robiose.

La r‘duction des nitratesne doit pas ’tre confondue avec la respiration des nitrates. Ce test consiste à rechercher après culture dans un bouillon nitrat‘, la pr‘sence de nitrite ou la disparition des nitrates. La r‘duction des nitrates peut ’tre due à l'enzyme coupl‘ à la respiration des nitrates (Nitrate r‘ductase A) mais ‘galement à une nitrate r‘ductase B ayant un rôle dans le m‘tabolisme de l'azote. ≥ne souche qui respire les nitrates possède donc toujours une activit‘ nitrate r‘ductase, mais l'inverse n'est pas vrai.

Les rapports des bact‘ries avec l'oxygène s'‘tudient en g‘lose profonde d‘soxyg‘n‘e par chauffage. On distingue :

Les bact‘ries a‘robies strictes qui ne poussent pas qu'en surface (bact‘rie à m‘tabolisme oxydatif a‘robie)

Les bact‘ries ana‘robies strictes qui ne poussent qu'en profondeur (bact‘ries à m‘tabolisme fermentatif pour lesquelles l'oxygène est toxique),

Les bact‘ries a‘ro-ana‘robies qui poussent sur toute la hauteur. Ces bact‘ries possèdent les 2 types de m‘tabolismes ou bien ce sont des bact‘ries fermentantes insensibles à l'oxygène comme les streptocoques,

Les bact‘ries microa‘rophilesqui ne poussent que quelques millimètres sous la surface (bact‘ries a‘robies strictes sensibles aux fortes concentrations d'oxygène).

La r‘action de l'oxydase permet la mise en ‘vidence du cytochrome C grâce à l'oxydation de la t‘tram‘thyl-paraph‘nylènediamine. Le cytochrome C est pr‘sent chez beaucoup de bact‘ries oxydantes mais pas chez toutes.

Une catalase capable de d‘grader l'eau oxyg‘n‘e en eau et oxygène (apparition de bulles d'oxygènes), est pr‘sente chez beaucoup de bact‘ries a‘robies ou a‘ro ana‘robies et souvent absente chez les bact‘ries ana‘robies. Cette enzyme sert à la d‘toxification de l'eau oxyg‘n‘e apparaissant au cours de certaines r‘actions m‘taboliques.

Ces marqueurs ont tous un poids taxonomique important et sont fr‘quemment utilis‘s dans les diagnostics d'orientation et de genre[38] .

Recherche de certains enzymes ou voies m‘taboliques :beaucoup de ces marqueurs ont unpoids taxonomique moindre que les pr‘c‘dents mais sont très fr‘quemment utilis‘s dans le diagnostic d'espèce. Ces marqueurs consistent à mettre en ‘vidence des activit‘s enzymatiques qui peuvent ’tre recherch‘es dans une culture en croissance ou après lyse des bact‘ries lib‘rant les enzymes recherch‘es. On recherche dans la culture le produit final d'un ensemble de r‘actions m‘taboliques (production d'ac‘toïne, H2S ou de cadav‘rine, etc.) ou on ‘value la transformation d'un substrat (ONPG, ur‘e, g‘latine, etc.) au contact d'une suspension bact‘rienne.

On peut citer :

L'utilisation des divers sucres avec production d'acides de fermentation et parfois de gaz, La production d'indole à partir de tryptophane,

La d‘gradation de l'ur‘e,

Les r‘actions de d‘samination ou de d‘carboxylation des acides amin‘s, L'hydrolyse de la g‘latine,

La production d'ac‘toïne par fermentation du glucose[45] . Etapes de l'identification d'une bact‘rie

 Diagnostic d'orientation et de genre  Diagnostic d'espèce

 S‘rotypie, Lysotype, biovars, antibiotypie

Figure 9:Les tests d'orientation pour l'identification des bacilles à Gram n‘gatif

Dans le tableau suivant, une liste (non exhaustive) des caractères ph‘notypiques couramment employ‘s pour l'identification bact‘rienne.

Tableau 2:Caractères utilis‘s en syst‘matique bact‘rienne

Observations et tests pr‘liminaires Coloration (Gram, bleu de m‘thylène )

Morphologie (bacille, coque...etc.)

Mobilit‘

Pr‘sence de spores (d‘formantes,

terminales)

Croissance en a‘robiose/ana‘robiose

H‘molyse sur g‘lose au sang

Production d une catalase

≤ests m‘taboliques ≤est à l oxydase

≤est à l ur‘ase ≤est de l indole Hydrolyse de l'hippurate Hydrolyse de l esculine Production d H2S S‘rologie Agglutination Immunochromatographie

≤est d inhibition Milieux s‘lectifs

Sensibilit‘ à l'optochine

Antibiotiques

Chimiotaxonomie Acides gras

Acides mycoliques

Système de quinone

Profil prot‘ique par PAGE

Pyrolyse - SM

3.2. Les systèmes d'identification manuelle

≤ous les systèmes d'identification commerciaux sont bas‘s sur cinque technologies diff‘rentes, ou une combinaison de celles-ci. ils comprennent les r‘actions bas‘es sur le pH et qui n‘cessitent 15 à 24H d'incubation, des r‘actions bas‘es sur les activit‘s enzymatiques et qui n‘cessitent 2 à 4h, l'utilisation des sources de carbone, la d‘tection visuelle de la croissance bact‘rienne, ou la d‘tection de volatiles ou non, des acides gras par chromatographie en phase gazeuse[48] .

3.2.1. API 20E

En 1971, Washington et al.ont publi‘ la première ‘valuation de l'API 20E, qui appartient depuis 1986 à bioM‘rieux, Inc (Durham, N.C.)[49] . ≥n imperm‘able support en plastique prend en charge 20 cupules qui contiennent des substrats à base de pH et qui n'ont pas

chang‘ depuis que le produit ‘tait lanc‘ en 1971. La base de donn‘es a augment‘ de 87 taxons en 1977 à 102 taxons en 2003 et contient Y. pestis. La base de donn‘es actuelle est une version 4.0. Les galeries API 20 E ont ‘t‘ compar‘es à de nombreux systèmes d'identification et en raison de son acceptation par la plupart des laboratoires de microbiologie internationaux, elle est devenue en quelque sorte un "Gold Standard" parmi tous les systèmes mises sur le march‘.

Des ‘tudes ont rapport‘ une capacit‘ d'identification ‘gal à 87% après 24H d'incubation et 96% après 48H pour les micro-organismes souvent rencontr‘s dans la routine hospitalière, par exemple, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, etc.). Pour les micro-organismes moins souvent isol‘s dans la clinique comme Providencia stuartii, Escherichia vulneris la bande API identifie seulement 78,7% des bact‘ries après 24H[50] .

En 1998, Neubauer et al.ont compar‘ la pr‘cision de quatre systèmes commerciaux pour identifier les Yersinia spp[51] . Parmi les 118 isolats test‘s, 93 (78,8%) ont ‘t‘ correctement identifi‘s avec API 20 E. O'hara et al.ont test‘ huit espèces de Vibrio et ont signal‘ une pr‘cision d'identification de 90% pour les Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus et

Photobacterium damselae par rapport aux tests biochimiques classiques. Cependant, les

Vibrio cholerae‘taient identifi‘s seulement avec 50% de pr‘cision[52] . 3.2.2. ID 32 E

L'ID 32 E de bioM‘rieux (Marcy l'etoile, France) est largement utilis‘ en Europe. Il s'agit d'une version am‘lior‘e de l'API 20 E et qui contient 32 substrats dans une configuration en plastique similaire à l'API 20 E. Leclerq et al. rapportent les capacit‘s du système dans la discrimination entre les isolats d'E. coli O157: H7 et E. coli non O157. M’me si les souches O157 ont montr‘ des r‘actions biochimiques atypiques, les identifications ‘taient correctes au niveau des espèces. Il n'yavait pas de profil biochimique unique (num‘ros) pour les souches O157, mais les chiffres ‘taient distincts de ceux des autres s‘rotypes[53] .

3.3. Antibiogrammes

Les antibiotiques utilisables en th‘rapeutique sont très nombreux et ils sont regroup‘s en familles selon leur structure chimique, ils sont ‘labor‘s par un micro-organisme ou produits par synthèse.Leur activit‘ sp‘cifique se manifeste à dose faible sur les micro-organismes. L'antibiogramme a pour but de d‘terminer les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) d'une souche bact‘rienne vis-à-vis ces antibiotiques. Par d‘finition (O.M.S.), la CMI est la plus faible concentration d'antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d'une bact‘rie donn‘e, appr‘ciable à l' il nu, après une p‘riode d'incubation donn‘e. La d‘termination des CMI ne peut ’tre envisag‘e en routine pour toutes les bact‘ries isol‘es et tous les antibiotiques test‘s et, reste r‘serv‘e à quelques cas particuliers

(pneumocoque de sensibilit‘ diminu‘e aux p‘nicillines, staphylocoques et ent‘rocoques r‘sistants aux glycopeptides, germes à croissance lente, infections s‘vères, etc.). La technique de l'antibiogramme est largement utilis‘e pour l'‘tude de la sensibilit‘ des bact‘ries aux antibiotiques.

Chaque antibiotique est caract‘ris‘ par son spectre d'activit‘ qui correspond aux diff‘rentes espèces bact‘riennes susceptibles d'’tre sensibles à son action. Selon les antibiotiques le spectre est limit‘ ou large. Exemples :

- La p‘nicilline G ou les macrolides ont un spectre limit‘ aux bact‘ries à Gram positif et aux coques à Gram n‘gatif.

- La colistine a un spectre ‘troit limit‘ aux bacilles à Gram n‘gatif à l'exception des Proteus sp., des Providencia sp., des Serratia sp.ou des Bacteroides sp.

- Le m‘tronidazole a un spectre d'activit‘ très particulier, car son action s'exerce uniquementsur les bact‘ries ana‘robies sauf les bacilles ana‘robies à Gram positif non sporul‘s.

- Les aminosides ou aminoglycosides ont un spectre large m’me si les bact‘ries ana‘robies sont r‘sistantes.

- Les t‘tracyclines, les ph‘nicol‘s et les sulfamides ont un spectre large et sont actifs sur les bacilles et les coques, à Gram positif ou à Gram n‘gatif, a‘robies ou ana‘robies ou a‘ro-ana‘robies. Enterococcus faecalis et les lactobacilles sont toutefois r‘sistants aux sulfamides[45] .

Des associations d'antibiotiques sont envisageables, voir m’me souhaitables, d'abord pour ‘largir le spectre antibact‘rien aussi bien pour les infections communautaires que pour les infections nosocomiales, puis pour limiter l'‘mergence de mutants r‘sistants à un seul traitement.

3.4. M‘thodes conventionnelles automatis‘es

L'AutoMicrobic System de l'ann‘e 1973 (AMS) (McDonnell Douglas Corp, Saint-Louis, Missouri) est reconnu aujourd'hui comme ‘tant la première g‘n‘ration du Vitek. Ce système a incorpor‘ un système de manipulation d'‘chantillons miniaturis‘s dans un dispositif jetable en plastique, avec la d‘tection microbienne par un mini-ordinateur qui gère le contrôle et le traitement des donn‘es. Les r‘sultats d'identification sont obtenus dans un temps de d‘tection de seulement 13H, avec 92% de bonne identification, quand le seuil de micro-organismes atteint 7. 104 ≥FC. En 10 ans, diff‘rents systèmes ont ‘t‘ mis sur le march‘, comme MS-2 (Abbott Diagnostics, Inc, Chicago, Illinois), le Autobac IDX (Pfizer Inc, Groto, Morris Plains, NJ), AutoScan-3 (MicroScan Corp, Hillsdale,N.J.). D'autres produits tels que le spectre BBL (Becton Dickinson) et le Quantum (Abbott Diagnostic) leur apparition ‘tait de

courte dur‘e. ≤outes ces technologies ont permis l'obtention de r‘sultats valides en peu de temps (4h)[54] .