La bact‘riologie m‘dicale, comme d'autres sciences, est ‘troitement li‘e à l'‘volution des techniques. Malgr‘ des intuitions parfois anciennes sur l'origine infectieuse de certaines maladies (Fracastor et ses th‘ories sur la contagion, au xviesiècle, Semmelweis et son concept sur la transmissibilit‘ de la fièvre puerp‘rale dans les maternit‘s de Vienne en 1844), ce sont des faits d'observation puis des faits exp‘rimentaux (grâce à la mise au point de l'outil essentiel, le microscope, dont A. Van Leeuwenhoek est l'inventeur indiscut‘) qui ont permis d'aboutir à la v‘ritable r‘volution microbiologique de l'ère pasteurienne. ≥ne liste chronologique, non exhaustive, des d‘couvertes de quelques bact‘ries agents de maladies infectieuses dominantes, de leur pouvoir pathogène et des m‘canismes de d‘fense de l'hôte infect‘, montre comment en quelques d‘cennies de la seconde moiti‘ du xixesiècle est n‘e la bact‘riologie m‘dicale [
Tableau 1:Chronologie des principales d‘couvertes de la
bact‘riologie (avant le vigntième siècle)
].[21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31]. L'abord de la bact‘riologie m‘dicale est indissociable des ‘tudes de microbiologie g‘n‘rale et de biologie mol‘culaire qui ont permis de d‘crire la physiologie et la g‘n‘tique des bact‘ries.Tableau 1:Chronologie des principales d‘couvertes de la bact‘riologie (avant le vigntième siècle) 1546 J‘rôme Fracastor (Fracastorius)
Il affirme l'existence de très petits organismes vivants, invisibles, capables de se reproduire et de se multiplier, qu'il appelle contagium vivum, ou seminaria contagionis.
Fracastor pose ‘galement les premières bases de l'‘pid‘miologie, en expliquant la contagion : transmission interhumaine par le contact, et transmission à distance par l'air
1659 Athanase Kircher La première mention d'une observation microbienne directe. Kircher croit voir de minuscules vers dans le sang des malades atteints de la peste
1680 Antoine Van Leeuwenhoek
Il d‘crit non seulement des protozoaires, mais aussi des bact‘ries, il observe dans le tartre dentaire « de petits animalcules se mouvant de façon charmante »
1730
Spallanzani
Il r‘ussit le premier à cultiver des bact‘ries dans des flacons contenant du jus de viande, ce sont les germes de l'air qui contaminent le liquide.
Il parvient à isoler un seul microbe dans une goutte d'eau, et le voit, au microscope, se diviser sous ses yeux, donnant naissance à deux, puis quatre descendants ; il a d‘couvert La division par scissiparit‘
1762 Von Plenciz insiste sur le rôle d'un « germe vermicul‘ » sp‘cifique de chaque maladie infectieuse
1844 Semmelweis ≤rait‘ de fou, il pressent l'origine infectieuse et le mode de contagion de la fièvre puerp‘rale, qui d‘cimait les accouch‘es dans les hôpitaux. Il incrimine sa transmission par les mains des internes qui soignent ces femmes après avoir fait des autopsies et il impose la d‘sinfection des mains à l'hypochlorite
1848 Devaine Voit des bacilles dans le sang des animaux atteints du charbon
1856 Pasteur Entreprend des travaux sur les fermentations et d‘truit le concept de g‘n‘ration spontan‘e
1860 Lister Entreprend des travaux sur la d‘sinfection des plaies
1865 Villemin Reproduit la tuberculose chez le cobaye
1874 Hensen D‘couvre le bacille de la lèpre
1876 Koch D‘couvre les spores du bacille du charbon
1879 Pasteur D‘montre le rôle de la bact‘ridie charbonneuse comme agent responsable exclusif du charbon
1879 Neisser D‘crit le gonocoque
1880 Pasteur Etudie le chol‘ra des poules et d‘couvre les vaccins att‘nu‘s
1880 Eberth D‘couvre le bacille de la typhoïde
1881 Koch Invente la s‘paration des bact‘ries par culture sur milieux solides
1882 Koch D‘couvre la bacille de la tuberculose
1882 Metchnikoff D‘crit la phagocytose et les cellules phagocytaires
1883 Klebs D‘couvre le bacille de la dipht‘rie
1883 Malassez et Vignal D‘couvrent le bacille de la pseudo-tuberculose
1884 Nicolaier D‘couvre le bacille du ≤‘tanos
1884 Koch Isole le vibrion chol‘rique
Ces ‘tudes ont conduit à mettre au point les proc‘d‘s d'isolement, d'identification, de typage et la caract‘risation des propri‘t‘s de virulence, de pathog‘n‘cit‘, de r‘sistance aux agents antimicrobiens, etc
2.1. Culture et isolement des bact‘ries
La première ‘tape du diagnostic bact‘riologique est l'obtention, en culture pure, de la souche bact‘rienne responsable des dommages observ‘s chez le malade, pour pouvoir ensuite l'‘tudier. Durant le processus infectieux, les bact‘ries se sont adapt‘es aux conditions de vie chez l'hôte, leur pr‘lèvement va consister à les transf‘rer dans un environnement diff‘rent où elles risquent de ne pas survivre. Cela impose, d'une part, un d‘lai très bref entre la collecte du produit à analyser et la mise en culture au laboratoire, et, d'autre part, l'utilisation d'un milieu de culture à la composition et à la temp‘rature d'incubation aussi proches que possible de celles du milieu naturel d'origine (diff‘rentes s‘cr‘tions ou tissus de l'hôte infect‘, s‘rosit‘s, pus, sang, biopsies d'organes, etc ). Comme les exigences particulières des bact‘ries dont la pr‘sence est soupçonn‘e sont encore inconnues à ce stade du diagnostic, la règle est d'ensemencer divers milieux empiriques, enrichis ou non en facteurs de croissance (sang ou extraits sanguins, par exemple) et, dans le cas d'associations bact‘riennes multiples, d'utiliser des milieux s‘lectifs (Drigalski) contre les bact‘ries commensales, pour favoriser ainsi la croissance sp‘cifique des bact‘ries pathogènes incrimin‘es à priori.
Figure 5 : Isolement de bact‘ries sur une g‘lose Mueller-Hinton, après un examen microscopique et une coloration de Gram.
Certaines bact‘ries ne sont pas cultivables en milieu artificiel ; les bact‘ries parasites intracellulaires obligatoires (Chlamydiales, Rickettsies) sont isol‘es par ensemencement sur cultures de cellules eucaryotes, mais d'autres telles que Treponema pallidum (agent de la syphilis) ou Mycobacterium leprae (agent de la lèpre) et sans doute d'autres agents encore
insoupçonn‘s ne b‘n‘ficient, à ce jour, pas encore de milieu d‘fini permettant leur croissance
in vitro[38] [39] .
Les milieux sont de diff‘rents types. Il s'agit soit de milieux de base permettant la croissance de micro-organismes non ou peu exigeants, soit de milieux enrichis par l'addition de diverses substances (s‘rum, uf, sang, vitamines, etc.) qui autorisent la croissance de bact‘ries plus exigeantes. Il peut s'agir ‘galement de milieux rendus s‘lectifs par addition d'antibiotiques, antiseptiques ou de colorants qui vont inhiber les bact‘ries sensibles à ces compos‘s. Les milieux d'isolement, contrairement aux milieux de culture, sont des milieux solides qui permettent d'obtenir des colonies isol‘es.
Les diff‘rents milieux de culture utilis‘s sont indispensables non seulement pour la croissance et la multiplication du pathogène d'int‘r’t, mais aussi pour permettre par la suite une identification bact‘rienne et l'‘tude de la sensibilit‘ aux antibiotiques lorsque la bact‘rie est isol‘e en culture pure. Certains milieux de culture solides (milieux chromogènes) qui grâce à la mise en ‘vidence d'activit‘ enzymatique, permettent l'identification directe de certaines espèces bact‘riennes, ou l'orientation vers certains groupes de bact‘ries. Les chromogènes sont des substrats artificiels incolores directement incorpor‘s dans la g‘lose, qui libèrent des compos‘s color‘s directement visibles après d‘gradation enzymatique (Par exemple, l'activit‘ -galactosidase produite par E. coliproduit des colonies roses à pourpres translucide). Ces milieux sont adapt‘s à l'isolement, l'identification et à la num‘ration des germes urinaires notamment, à titre d'exemple on peut citer, le milieu CHROMagar Orientation® (Becton Dickinson), le milieu CPS ID3® (bioM‘rieux), ≥riSelect 4®(Bio-Rad) ou UTI® (Oxo”d). D'autres chromogènes sont d‘velopp‘s pour le d‘pistage du portage g‘nital de Streptococcus agalactiae, du portage nasal de S. aureus r‘sistant à l'oxacilline, le d‘pistage des bact‘ries multi-r‘sistantes ou la recherche de Salmonelles à partir de selles.
2.2. La classification des bact‘ries
En bact‘riologie clinique, il est important d'identifier avec pr‘cision les souches bact‘riennes isol‘es au cours des processus infectieux. En effet, la croissance d une bact‘rie permet d‘jà de pr‘voir le pouvoir pathogène d'une souche, son appartenance à la flore commensale ou à l'environnement, sasensibilit‘ aux antibiotiques, etc. De plus, beaucoup de marqueurs d'identification sont ‘galement des traceurs ‘pid‘miologiques.
Figure 6 :Arbre phylog‘n‘tique montrant la diversit‘ des bact‘ries, compar‘es aux autres organismes. Les eucaryotes sont color‘s en rouges, les archaea en vert et les bact‘ries en bleu [14] [8] .
Identifier une bact‘rie, c'est d‘terminer à quel groupe taxonomique (taxon) elle appartient. La d‘finition des groupes taxonomiques et les rapports qu'ils ont entre eux (classification bact‘rienne) sont p‘riodiquement remis à jour dans des ouvrages de r‘f‘rence comme le Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology.
L'unit‘ taxonomique de base est l'espèce bact‘rienne. En toute rigueur, les souches appartenant à une m’me espèce, d‘rivent d'un anc’tre commun et possèdent des structures g‘n‘tiques très voisines (genospecies). Les structures g‘n‘tiques n'‘tant pas facilement accessibles à l'analyse, on regroupe en g‘n‘ral les souches dans des phenospecies (ou taxospecies) sur la base de leurs caractères ph‘notypiques et de leur adaptation ‘cologique. Pour des raisons pratiques on peut ‘galement ’tre amen‘ à regrouper des bact‘ries en fonction d'une propri‘t‘ importante en bact‘riologie m‘dicale (bact‘ries ent‘rotoxinogènes, bact‘ries productrices de b’ta lactamases, etc.
Les espèces bact‘riennes sont regroup‘es sur des bases moins rigoureuses en genres et en familles. Elles peuvent ’tre subdivis‘es en sous-espèces ou biovars et en s‘rotypes[40] [41] [42] [43] .
2.3. L'identification bact‘rienne
Les bact‘ries susceptibles d'’tre rencontr‘es en bact‘riologie clinique sont en nombre relativement restreint (quelques centaines sont pathogènes) en regard de la grande complexit‘ du monde bact‘rien. De plus, le diagnostic est très souvent orient‘ par la nature de l'infection et le type de pr‘lèvement. Le plus souvent, le bact‘riologiste aura un choix à faire parmi les bact‘ries pr‘sentes à l'isolement et il n'identifiera avec pr‘cision que celles qui peuvent jouer un rôle dans le processus infectieux.
Il n'est pas toujours n‘cessaire de pousser très loin le diagnostic. L'espèce et parfois le s‘rotype sont presque toujours suffisants. Par contre, les m‘thodes de diagnostic choisies devront ’tre rapides et permettre de donner un diagnostic pr‘somptif approch‘ 24 heures après le pr‘lèvement, un diagnostic d‘finitif et un antibiogramme interviennent 24 à 48 heures plus tard.
La d‘marche diagnostique se fait g‘n‘ralement en 3 ‘tapes : Diagnostic d'orientation,
Diagnostic d'espèce,
D‘termination de marqueurs ‘pid‘miologiques ou utiles au traitement (s‘rotype, Biovar, antibiotype ).
Le diagnostic d'orientation commence par le rep‘rage des divers types coloniaux sur les milieux d'isolement. Chacune des souches reconnues devra ’tre class‘e dans un groupe taxonomique, g‘n‘ralement le genre ou la famille. Pour cette importante ‘tape, on fait appel à des marqueurs fiables et de pr‘f‘rence rapides à obtenir (morphologie, Gram, m‘tabolisme ‘nerg‘tique, mobilit‘, oxydase, catalase, etc.) l'appartenance à un genre ou une famille sera ult‘rieurement confirm‘e par les caractères d‘finissant le groupe taxonomique consid‘r‘.
Le diagnostic d'espèce est r‘alis‘ grâce à un plus grand nombre de tests diagnostics. Ces tests sont bien standardis‘s, de nombreux sch‘mas d'identification existent pour les interpr‘ter et des "Kits" diagnostiques performants sont en vente dans le commerce (API Système par exemple). Pour ces raisons, cette deuxième ‘tape n'offre en g‘n‘ral que peu de difficult‘ si toutefois, la première a ‘t‘ bien men‘e. En effet, la nature des tests d'identification à pratiquer d‘pend du groupe bact‘rien dans lequel le diagnostic a ‘t‘ orient‘. ≥tiliser d'embl‘e une galerie pour ent‘robact‘ries sur un germe qui est peut ’tre un Pseudomonas ou une Neisseria peut aboutir à une impasse ou à une erreur diagnostique.
La dernière ‘tape consiste à rechercher des marqueurs pouvant influencer le traitement (antibiotype), permettre une compr‘hension du rôle pathogène de la souche (recherche d'une toxine) ou constituer des marqueurs ‘pid‘miologiques (s‘rotypes, s‘rolyses).
≥ne d‘marche classique de l'analyse effectu‘e en laboratoire pour la mise en ‘vidence d'une bact‘rie, à partir d'un pr‘lèvement est sch‘matis‘e ci-dessous (