A partir d'une pr‘culture de 3 mL, on ensemence 25 mL de milieu 2 X ≤Y puis on incube à 37°C. Lorsque la culture atteint une DO à 600 nm de 0,4, les cellules sont centrifug‘es pendant 2 min à 5000 x g à 4°C. Le culot bact‘rien est lav‘ deux fois avec 5 mL de tampon PIV (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA acide, 10 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 7,5), resuspendu dans 600 L du m’me tampon, puis 300 L de la suspension sont chauff‘s à 55°C pendant 10 min avant d'’tre m‘lang‘s à 600 L d'agarose à bas point de fusion (Appligène, France) liquide 2% (p/v) dans 50 mM Tris-HCl, 5 mM ED≤A, pH 8,0 puis chauff‘ encore pendant 10 min à 55°
C. Le m‘lange est ensuite coul‘ dans les puits (25x3x3 mm3) d'un support en plastique puis refroidi. Les tranches d'agarose ainsi obtenues sont transf‘r‘es dans des tubes contenant 1,5 mL de tampon de lyse "EC lysis Buffer", 50 µg/mL de lysostaphine (Sigma) et 500 g/mL de lysozyme (Sigma). La lyse des parois bact‘riennes emprisonn‘es dans l'agarose s'effectue pendant toute la nuit à 0°C. Le tampon de lyse est ensuite remplac‘ par 1,5 mL de tampon de prot‘olyse (0,25 M ED≤ANa2, 20 mM EG≤A, 1% lauroyl sarcosine (p/v), pH 9.0, et 250 g/mL de prot‘inase K). La digestion dure 24h à 55°C. La prot‘inase K est ‘limin‘e par 4 lavages par du ≤E à 0,1 mM de PMSF. Les tranches d'agarose sont ensuite lav‘es 4 fois avec du ≤E seul pour ‘liminer le PMSF. Elles peuvent ’tre ainsi conserv‘es pendant 12 mois à 4°C en changeant le tampon tous les mois[66] .
12.3. Hydrolyse de l'ADN
L'enzyme de restriction SmaI (CCC/GGG) est utilis‘ dans les conditions d‘crites par le fournisseur (Sigma). Le morceau d'agarose (5x3x3 mm) est ‘quilibr‘ pendant 30 min dans 300 L de tampon SmaI à 4°C. L'hydrolyse s'effectue à temp‘rature ambiante dans un volume final de 60 L contenant 10 ≥ d'enzyme pendant au moins 3h à 25°C.
12.4. Electrophorèse en champs puls‘ pour les S. aureus (Migration)
Elle est r‘alis‘e sur un appareil GenePath de Bio-Rad≤M bas‘ sur la m‘thode de champ puls‘ de CHEF (Contoured Clamped Homogeneous Electric Field) ; diff‘rents champs ‘lectriques sont activ‘s alternativement et situ‘s perpendiculairement l un par rapport l autre. Sous l effet de ces champs alternatifs, les mol‘cules d ADN progressent dans l agar plus rapidement que dans un champ lin‘aire et sont s‘par‘es selon leur taille. Le r‘sultat, obtenu en 24h après r‘v‘lation de l ADN, est unprofil de macro-restriction d‘finissant un pulsotype. Les paramètres de migration ‘taient les suivants : voltage à 6 V/cm ; angle à 120°; rampe de pulse de 20 à 5 s pendant 24 h pour les fragments de 20 à 200 kb ; une rampe de pulse suppl‘mentaire de 40 à 20 s est r‘alis‘e pendant 24 h pour s‘parer les fragments de plus de 200 kb. ≥n marqueur de poids mol‘culaire lambda (concat‘mères successifs de 48.5 kb) ‘tait utilis‘. Les gels ‘taient color‘s par du BE≤ et photographi‘s sous lumière ≥V.
Le gel pr‘par‘ de 1% contient 15 puits (14 ‘chantillons et le marqueur de taille : lambda ladder) dans lesquels sont plac‘s les plugs contenant l'ADN (~3 mm), qui sont par la suite recouverts d'agarose. Le tampon d'‘lectrophorèse pur (volume 100 mL) est dilu‘ dans un volume final de 2L d'H2O (P≥RELAB) et vers‘ dans le bac d'‘lectrophorèse de sorte à immerger le gel. L'‘lectrophorèse est mise en route pour 19,7 h après avoir lanc‘ la pompe (courant de 70 à 80) et v‘rifi‘ que la temp‘rature du tampon est de 14°C. Le programme
choisi pour le champ ‘lectrique altern‘ est celui pour staphylocoque. L'ADN contenu dans le gel est color‘ au BE≤ (1 mg/mL) pendant environ 15 min, puis le gel est d‘color‘ dans 500 mL d'H2O pendant 30 à 60 min. Le gel est finalement r‘v‘l‘ aux ≥V et le système GelDocTM 1000 (BioRad). Les tailles des bandes d'ADN des ‘chantillons sont d‘termin‘es par rapport à celles du lambda « ladder ». Les profils PFGE ont ‘t‘ analys‘s avec le logiciel DiversityTM database version 2.0 ; BioRad. Les profils de PFGE ont ‘t‘ assign‘s temporellement et les types ont ‘t‘ d‘finis en fonction des diff‘rences d'une ou de plusieurs bandes entre les souches.
12.5. PFGE pour les souches de Vibrio sp
L analyse PFGE a ‘t‘ r‘alis‘e avec Genepath Group ® Kit de r‘actifs 3 selon les instructions du fabricant (Bio-Rad diagnostic, Ivry sur Seine, France). Brièvement, 100 µl de suspension bact‘rienne ont ‘t‘ centrifug‘s et remis en suspension dans le tampon fourni par le kit. Les bouchons d'agarose ont ‘t‘ pr‘par‘s en m‘langeant des volumes ‘gaux de suspensions bact‘riennes avec 1% (poids / volume) à faible point de fusion d'agarose (Bio-Rad). Les cellules dans les bouchons d'agarose ont ‘t‘ lys‘es par la solution de lyse et incub‘s 1 h à 37 ° C. Puis les cellules sont trait‘es avec la prot‘inase K solution et incub‘s 18 h à 50 ° C. L'ADN g‘nomique int‘gr‘e dans les bouchons d'agarose a ‘t‘ dig‘r‘ par l endonucl‘ase de restriction Notl. Un standard de taille d'ADN (bact‘riophage ‘chelle; Bio-Rad) a ‘t‘ utilis‘ comme un marqueur de taille mol‘culaire. Le champ ‘lectrique altern‘ est r‘alis‘ en utilisant le programme "13" pr‘-enregistr‘s dans le module de contrôle de l'appareil Bio-Rad, fix‘ pour 6,0 V / cm à une temp‘rature de 15 ° C pendant 18 h avec un 1-15 s lin‘aires temps d'impulsion rampe et avec 50 uM thiour‘e ajout‘ à tampon. Les gels ont ‘t‘ color‘s par immersion dans une solution de bromure d'‘thidium et photographi‘s sous ‘clairage ≥V.
12.6. Lecture (pour les S. aureus et les Vibrio sp)
La lecture ‘tait r‘alis‘e à l aide du logiciel Bio Image version 4.0 (Genomic Solutions Inc.). Les bandes ‘taient num‘rot‘es de 1 à n, de la bande de plus haut poids mol‘culaire à la bande de plus faible poids mol‘culaire.
Les images num‘ris‘es du gel ont ‘t‘ converties, normalis‘es en alignant les normes de taille situ‘es dans les couloirs ext‘rieurs du gel à la norme de r‘f‘rence pour la base de donn‘es. L'analyse des profils de bandes a ‘t‘ r‘alis‘e avec le coefficient de Dice utilisant 1% de tol‘rance pour la distance de migration de bande. L'analyse de classification hi‘rarchique a ‘t‘ r‘alis‘e et un dendrogramme a ‘t‘ produit avec le logiciel.
12.7. Critères d interpr‘tation (pour les S. aureus)
Selon les critères de ≤enover et al., 1995[111] les souches sont consid‘r‘es comme identiques si toutes les bandes correspondent entre elles, ‘pid‘miologiquement reli‘es s il y a de une à trois bandes de diff‘rence et possiblement apparent‘es s il y a 4 à 6 bandes de diff‘rence. Les isolats qui diffèrent par 7 fragments ne peuvent plus ’tre consid‘r‘s comme ‘pid‘miologiquement li‘s.
L analyse assist‘e par ordinateur des profils PFGE de bandes a ‘t‘ effectu‘e en utilisant Fingerprinting II (Bio-Rad Laboratories).
12.8. Critères d'interpr‘tation (Pour les Vibrio sp
L'analyse des profils de bandes a ‘t‘ r‘alis‘e avec le coefficient de Dice utilisant 1% de tol‘rance pour la distance de migration bande. Analyse de classification hi‘rarchique a ‘t‘ r‘alis‘e par la m‘thode du groupe paire non pond‘r‘ par la moyenne arithm‘tique, et un dendrogramme a ‘t‘ produit avec le logiciel.