Dans cette ‘tude, nous avons utilis‘ la PFGEpour enqu’ter surle contenudu g‘nome desouches Vibrio cholerae O1non toxigènes. Les donn‘es obtenuespar PFGEsuggèrent queV.cholerae non-O1isol‘es dediff‘rentesusines de traitement deseaux us‘esau cours de cetteenqu’te sontlargementh‘t‘rogènesau niveau g‘nomique. ≥ne pr‘occupation majeurede cette ‘tude‘tait la pr‘sence d'un haut niveau de PFGE de souches V.cholerae non-O1non typablesavecNotl(environ19%).Les souchesqui sontnon typablespar PFGEpeuventprobablement ’trele r‘sultatde la m‘thylationde l'ADN g‘nomique
[147]
, ou de sa d‘gradationau cours du processus[148]
.MALDI-≤OF/MS estprincipalement bas‘esur la d‘tection desfractions prot‘iquesribosomalesdesbact‘ries, quisont les plus abondantset conserv‘es
[149]
. Un objectif suppl‘mentairede cette‘tude ‘tait d'‘tudierla capacit‘ desprofils spectralsbact‘riensMALDI-≤OF/MS pour distinguer et caract‘riser rapidementlesisolats environnementauxde V. choleraenon-O1en utilisant lelogiciel Biotyper 1.1.Le dendrogrammebas‘sur les profilsde masse spectrale MALDI-TOF de V. cholerae non-O1isol‘esà partir des troisusines de traitement deseaux us‘esa ‘t‘diff‘rent deceux d‘termin‘spar PFGE, mais les deux m‘thodes ontmontr‘ une capacit‘ de produiredes «empreintes»qui sontsp‘cifiques à la souche. En outre, avecMALDI-≤OFBiotyper 1.1 etselon les paramètreschoisis, nous avons observ‘ unediscrimination consid‘rabledes isolats bact‘riens. MALDI-≤OF/MSa un potentielutile àla taxonomie et l'‘pid‘miologierapide bas‘e surdes biomarqueurs prot‘iques
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pour r‘soudre lessouches ‘troitement apparent‘esdeVibriosp, car il y a des variations de s‘quences intrasp‘cifiquesen terme demasse mol‘culaire, autant que des variations de l'inter-espèce
[151]
.Le clustering desdonn‘es MALDI-≤OF/MSont r‘v‘l‘ undegr‘ de regroupementd'espèces sp‘cifiques plus ‘lev‘ par rapportà celui observ‘ avecl'‘lectrophorèseen champ puls‘(PFGE), exemple, la souche V. metschnikovii, fait partie d'un cluster quirassemble les souches Vibrio choleraenon-O1dans l'analysePFGE, alors qu'elle se trouve sur une branche en dehors des Vibrio cholerae non O1 par l'analyse MALDI-TOF/MS.L'analyse des spectres a ‘t‘ r‘alis‘e par les outils associ‘s à l'algorithme Biotyper1.1TM et la g‘n‘ration des dendrogrammes s'est faite par defaut dans un premier lieu, puis dans un second temps et pour faire une comparaison ad‘quate, les diff‘rents profils spectraux après proccessing ont fait l'objet de comparaisons utilisant le m’me logiciel qui a servi à cr‘er un dendrogramme de classification des profils PFGE. Les diff‘rents pics de chaque spectre de masse ont ‘t‘ consid‘r‘s comme une entit‘ diff‘rente utilisant l'outil de cr‘ation de pseudogel
qui ressemble à un profil de restriction de la PFGE. Le dendrogramme g‘n‘r‘ à partir du pseudogel (Biotyper1.1TM) et le dendrogramme g‘n‘r‘ à partir des diff‘rents pulsotypes nous a permis de conclure sur le pouvoir discriminant des profils spectraux r‘alis‘s par MALDI-TOF/MS.
Dans un article r‘cent dont nous aurons la possibilit‘ de discuter ci-après, nous avons montr‘ qu'au sein m’me des diff‘rents d‘pôts de la m’me souche bact‘rienne beaucoup de pics mineurs sont assez variables et du coup peuvent jouer un rôle d‘terminant quand à l'utilisation de cette technique comme outil de typage. Ces ‘l‘ments sont assez cruciaux et doivent ’tre pr‘sents dans une bonne m‘thode de typage, par cons‘quent les r‘sultats de typage obtenus dans cette ‘tude sur les Vibriom‘ritent un re-examen concernant ces points variables utilisant la proc‘dure que nous avons d‘velopp‘e r‘cemment et qui nous a permis de diff‘rencier deux bact‘ries très proches (E. coli et Shigella).
3.6. ARTICLE 4 : Discrimination des E. coli&
3.6.1. L'identification des E. coli et des Shigelles est-elle possible par MALDI-TOF?
Les identifications correctesconstamment‘taient obtenues par MALDI-TOF/MS lorsqueseulesles prot‘ines les plusabondamment exprim‘es(par exempleprot‘ines ribosomales) ont ‘t‘ dansla base de donn‘es[92] . Une fois que les spectres deMALDI-≤OF/MSsontrecueillis,de formes multiples del'analysedes donn‘espeuvent’tre effectu‘es surces donn‘es pourdiscriminer lesgenres, espèces, soucheset m’medes micro-organismes. Sur cette base, nous avons essay‘ d'effectuer plusieurs tests de discrimination entre les diff‘rentes souches de la m’me bact‘rie utilisant le Biotyper1.1TM et quelques traitements in silico des diff‘rents profils spectraux. Le but d'abord ‘tait de discriminer deux bact‘ries très proches (Shigella.sp vs E. coli), et utiliser la m’me proc‘dure dans un but de typage bact‘rien (utilisation universelle).
3.6.2. L'identification des Shigella et des Escherichia coli par MALDIBiotyper
Environ 1,1million de mortset de 160millions de caspar ansont attribu‘s àla shigellose. De nombreuses analyses mol‘culairesimpliquantl'hybridationde l'ADN, l'‘lectrophorèse enzymatique multilocus, et le s‘quençagedesgènes de m‘nageindiquent qu'Escherichia coli
ettous les membres dugenre Shigellaappartiennent àla m’me espèce. ≤ous les systèmes commerciaux utilis‘s actuellement pour l'identification des microrganismes par MALDI-≤OF/MS ne peuvent diff‘rentier ces deux bact‘ries. Pour distinguer lessouches pathogènes
dehaute pertinence cliniquedes souchesmoinspathogènes ounon pathogènes, le genre
Shigellaa ‘t‘d‘fini sur la basedes ph‘notypesbiochimiques, s‘rologiques et cliniques.≤outefois, l'identificationdes agents pathogènesconventionnelsà partird'‘chantillons f‘cauxpar cultures‘lective etdosages biochimiquessontcomplexe et fastidieuse. L'objectif de ce rapport ‘tait d'‘valuer la sensibilit‘ et la sp‘cificit‘ de MALDI-TOF MS afin d'explorer son pouvoir discriminant pour d‘tecter des diff‘rences subtiles entre les deux genres Escherichia coli vs Shigellasp. Nous avons essay‘ de rep‘rer des biomarqueurs de peptides en utilisant d'abord une analyse pr‘liminaire bas‘e sur un ‘l‘ment qui influence la physiologie microbienne, c'est à dire les conditions de culture (temp‘rature, milieux de culture), mais aussi des facteurs li‘s aux protocoles et le traitement des donn‘es. Des informations sur les modifications globales de ces composants de surface cellulaire peuvent alors apparaitre, permettant que cette information soit utilis‘e pour l'identification des espèces de Shigella. En outre, nous avons compar‘ deux protocoles utilis‘s pour identifier les bact‘ries par ce système (smear ou le d‘pôt direct de la colonie et l'extraction de prot‘ines), le but est alors d'instaurer les ‘l‘ments id‘aux pour une meilleure discrimination reproductible.
Dans ce travail,un critère objectif pourmarquerla qualit‘ des donn‘esdes spectresest d‘crit, et en fonction des conditionstechniques,un protocoleoptimal pourl'analyse despics reproductiblesdes spectres de masseest ‘tabli.Ce nouveau conceptest test‘par le logicielBiotyperTM 1.1pour validerMALDI-TOF/MSpour l'identification deShigellaet Escherichia coli (pathogènes oucommensalles). Deuxbases de donn‘esincr‘ment‘es par de souchesdiff‘rentes r‘colt‘es dansnotre laboratoireou d'autres centres nationaux et internationaux. Nous d‘montrons la capacit‘de cette techniquepour s‘parer lesdeuxgenres etidentifier les souchesau niveau de l'espèce à partir d'un milieu solide.
3.6.3.PreDatabase et les effets des conditions de culture
Base de donn‘es par d‘faut (tel que d‘crite dans le manuel de Biotyper1.1 )
Pendant le processus de g‘n‘ration de spectres d'une database principale appliqu‘e à E. coli
et Shigella sp, trois pre-databases successives de Biotyper ont ‘t‘ cr‘‘es et enregistr‘es pour d'autres applications, tel que d‘crit et recommand‘ par le fabricant (BiotyperTM 1.1 le manuel). L'algorithme choisit automatiquement les pics significatifs (tous les spectres de la m’me souche ont ‘t‘ compar‘s les uns aux autres et un score attribu‘).
Dans notre application, cette base de donn‘es sera utilis‘e comme une preDatabase, car il ne repr‘sente pas la base de donn‘es finale. Pour obtenir les conditions optimales et repr‘sentatives, plusieurs preDatabases ‘taient cr‘‘es repr‘sentant des paramètres diff‘rents comme la temp‘rature ≤ °, le temps d'incubation, milieux de culture et pr‘paration de l'‘chantillon, chacune pouvant affecter les pics g‘n‘r‘s constituant un spectre. ≥ne fois la
preDatabase cr‘‘e pour chaque condition de culture bact‘rienne, la comparaison entre preDatabases des diff‘rentes conditions de croissance a ‘t‘ r‘alis‘e. FlexAnalysisTM 3.0 (Bruker Daltonics) a ‘t‘ utilis‘ pour une inspection visuelle. En outre, BiotyperTM1.1 a permis une analyse de comparaison de cluster utilisant des dendrogrammes et des distributions en 2D. Se basant sur ces comparaisons, les spectres acquis dans des conditions optimales (conditions où les bact‘ries sont mieux s‘par‘es) ont ‘t‘ s‘lectionn‘s et conserv‘s pour cr‘er une base de donn‘es finale.
3.6. ≥n nouveau concept pour la base de donn‘es finale
Nous avons d‘velopp‘ un nouveau concept pour la cr‘ation d'une nouvelle Database. Par d‘faut, l'algorithme a cr‘‘ une bibliothèque d‘di‘e (contenant des spectres de r‘f‘rence sp‘cifique du genre et de l'espèce). La fonction int‘gr‘e - Set Editor - dans BiotyperTM1.1 permet un d‘pistage visuel des diff‘rentes informations concernant les pics pr‘sents dans le spectre moyen (10 spectres bruts appari‘s pour chaque isolat), l'intensit‘ du pic, Signal sur bruit S/N, fr‘quence de l'apparition des pics dans les 10 spectres moyenn‘s en un spectre ... etc ; mais aussi permet de supprimer des pics ou leur donner des valeurs qui peuvent faire la diff‘rence. En se basant sur les informations donn‘es par Set-Editor (BiotyperTM1.1) et pour une grande reproductibilit‘ de la nouvelle strat‘gie, la m‘thode a consist‘ à s‘lectionner des pics ayant une fr‘quence de 100% pour un (
Figure 9
) isolat donn‘. ≥e pic do”t ’tre pr‘sent dans les 10 spectres constituant le spectre moyen de l'isolat (ou l'entr‘e dans la base de donn‘es). Après la suppression des pics non reproductibles, ce spectre moyen r‘duit pour un isolat donn‘ contient encore assez de pics pour obtenir une identification pr‘cise. Par cons‘quent, les spectres r‘duits n'‘liminent pas les informations utiles pour le calcul d'un log score, au contraire il leur confère une valeur proportionnelle plus importante. La variabilit‘ dans l'intensit‘ spectrale n'a pas ‘t‘ ‘limin‘e. Cette approche a ‘t‘ r‘alis‘e sur toutes les souches inclues ou non dans la base finale. La base de donn‘es finale a ‘t‘ sauvegard‘e pour les tests d'identification en aveugle. ≥ne r‘p‘tition de l'analyse des ‘chantillons donn‘s a ‘t‘ r‘alis‘e (n = 5) afin d'obtenir des spectres ne contenant que des pics reproductibles. Les conditions optimales observ‘es dans cette ‘tude pour g‘n‘rer des spectres pouvant ’tre utilis‘es pour la cr‘ation d'une banque capable de diff‘rencier les deux bact‘ries ‘taient les suivantes : (culture sur milieu Drigalski, ≤ 37°C, 10 spectres pour chaque souche, -4-cyano hydroxycinnamique comme matrice, et l'extraction prot‘ines pour la pr‘paration des ‘chantillons).3.6. Article (RETENU)