Reproductibilité inter- et intra-laboratoire
1.3. Effets des conditions de cultures
Dix souches de S. aureus de la collection IBS (SP61, 2976, SP116c, 678, 1320, 3452, 3465, 3475, 11960, 12648) ont ‘t‘ cultiv‘es sur 5 milieux de culture diff‘rents à 37°C pendant 18h, 48h et 72h sans repiquage interm‘diaire, afin d'avoir une vue globale sur les effets qui pourraient influencer les spectres et promouvoir les meilleures conditions de pr‘-analyse. Nous constatons que les milieux de culture ont une influence sur le contenu des spectres des diff‘rentes souches, la souche IBS12684 ‘tant prise en exemple dans la Figure 28. Nous constatons que des pics peuvent dispara”tre en fonction des milieux utilis‘s et que les spectres acquis après culture sur g‘lose au sang sont les plus riches en nombre de pics. Concernant le temps de culture, BiotyperTM1.1 repère des diff‘rences et distingue les souches de manière flagrante quand elles ont ‘t‘ cultiv‘es 18h ou 48h, ou encore durant 72h (
Figure
28
). Ce classement est observ‘ de la m’me manière pour toutes les souches. Ceci s'explique par le fait que les bact‘ries incub‘es pendant plus de 18h sont en phase stationnaire de croissance ; leur m‘tabolisme est modifi‘ et les ph‘nomènes d autolyse s installent. Ainsi, le nombre de ribosomes diminue, certaines r‘gulations sont mises en place et la fr‘quence de mutations est plus importante du fait du vieillissement des cellules et des carences du milieu de culture et de la pr‘sence de m‘tabolites. Il est donc pr‘f‘rable et non obligatoire d'utiliser des cultures fra”ches de moins de 24h pour toute analyse. Mais, globalement l'identificationsous diff‘rentes conditions de culture est affect‘e par la valeur du log score calcul‘, et elle n'est influenc‘e que quand il s'agit de l'identification de bact‘ries très proches.
1.4. Reproductibilit‘ pour une identification au niveau de l'espèce
La reproductibilit‘ de l'analyse par la MALDI-≤OF/MS a ‘t‘ test‘e sur 5 souches de S. aureus
(collection IBS n°1315, 1381, 1505, 2978, 3223) et une souche de Staphylococcus capitis à coagulase n‘gative (B177) cultiv‘es sur g‘lose au sang pendant 14 jours à 37°C avec repiquages quotidiens (
Figure 24
). Les spectres de masse des extraits frais de ces six souches pr‘sentent des pics de masse comparables (pics majeurs ; intensit‘ de 10%), et nous ne notons pas de variation des spectres. Cependant, on observe quelques variations d intensit‘ de quelques pics non d‘pendants des masses respectives ou de la p‘riode de repiquage. Ces variations pourraient ’tre le r‘sultat d homog‘n‘isations non ‘quivalentes et de pipetages des extraits pour leur d‘pôt sur la plaque cible. En effet en insistant sur ces phases, nous avons alors obtenu des r‘sultats mieux comparables (15s de vortex et d‘pôts des tripliqu‘s dans les 30s suivantes).Nous en d‘duisons que la reproductibilit‘ de l'analyse des extraits prot‘iques est bonne, car il y a une constance des pics majoritaires, au moins pendant la p‘riode test‘e de 14 jours. Cependant, les variations d intensit‘, et les pics mineurs, bien que minimes nous interpellent quant aux proc‘dures de stockage et d homog‘n‘isation des extraits, mais aussi sur l apport de m‘thodes de pr‘paration automatis‘es des plaques.
1.5. Reproductibilit‘ pour faire du typage bact‘rien
Dans le but de tester le pouvoir discriminatoire de la technique MALDI-TOF/MS, plusieurs d‘pôts du m’me extrait prot‘ique ont ‘t‘ r‘alis‘s à partir d'une souche E. coli cultiv‘e sur diff‘rents milieux de culture. Des variations ont ‘t‘ remarqu‘es qui sont dûes aux conditions d'homog‘nisation de l'extrait prot‘ique. Ces variations repr‘sentent en g‘n‘ral des pics mineurs et qui peuvent nuire à l'utilisation de la technique dans le cadre du typage des souches bact‘riennes. Pour am‘liorer les performances de la technique et sa reproductibilit‘ pour sous-typer les souches de la m’me bact‘rie, nous avons proc‘der à la suppression de ces pics mineurs qui varient d'un spectre à l'autre. Cette suppression des pics variables nous a permis de diff‘rencier deux bact‘ries très proches l'une de l'autre consid‘r‘es par les m‘thodes universelles de typage comme une seule espèce (Escherichia coli & Shigella sp.). N‘anmoins, la reproductibilit‘ est am‘lior‘e utilisant notre suggestion de supprimer les pics mineurs, augmente le degr‘ de performance d'identification bact‘rienne, mais aussi la
diff‘rentiation des souches appartenant à la m’me espèce. (Voir : le typage bact‘rien, partie r‘sultats).
Les diff‘rentes conditions de culture ont fait l'objet d'une ‘valuation suppl‘mentaire où 7 espèces bact‘riennes ont ‘t‘ analys‘es. ≤emp‘rature, dur‘e d'incubation et les diff‘rents milieux de culture utilis‘s g‘n‘ralement dans la routine hospitalière ont ‘t‘ test‘s. L'objectif ‘tait de tester la robustesse et la sensibilit‘ du calcul du log score d‘di‘ à l'identification au niveau de l'espèce si on fait varier les conditions de culture. Les r‘sultats obtenus nous ont montr‘ une reproductibilit‘ efficace par rapport à tous les ‘l‘ments test‘s. (Voir ci-dessous
Tableau 4
).Figure :Spectres de masse obtenus par MALDI-≤OF/MS dans les m’mes conditions (20 fois 50 tirs) de la souche commerciale E.coli BL21 d‘pos‘e en tripliqu‘ permettant l'‘tude de la r‘p‘tabilit‘ de l'analyse.
Figure :Spectres de masse obtenus par MALDI-TOF/MS, des extraits frais de la souche 1315, S. aureus, cultiv‘ sur g‘lose au sang à 37°C avec repiquage quotidien permettant l'‘tude de la reproductibilit‘ de la manipulation à diff‘rents temps.
Figure :Spectres de masse obtenus par MALDITOF/MS de la souche S. intermedius B169 conserv‘e à 4 °C pendant 4 semaines. A : après 24H de conservation ; B : après une semaine ; C : après deux semaines ; D : après trois semaines ; E : après 4 semaines
Figure :Spectres de masse obtenus par MALDI-TOF/MS de la souche S. intermedius B169 conserv‘e à -20 °C pendant 4 semaines. A : après 24H de conservation ; B : après une semaine ; C : après deux semaines ; D : après trois semaines ; E : après 4 semaines.
Figure :Profils multiples de la souche S. aureus12684 cultiv‘e dans les diff‘rents milieux de cultures. Les diff‘rents profils sont pr‘-trait‘s par Biotyper1.1. 1 : Bacto Heart Infusion (BHI), 2 : G‘lose au sang (GS), 3 : Müller Hinton (MH), 4 : Nutrient Broth (N2), 5 : ≤ryptone Yeast (≤Y), r‘alis‘ par le BiotyperTM 1.1.
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Figure :Profils multiples d une souche de S. aureus (12684) cultiv‘e dans le milieu g‘lose au sang et incub‘e pendant : 24 h, 48h et 72h à 37°C et sans repiquage quotidien. Les spectres de masse ont d‘jà ‘t‘ trait‘s par BiotyperTM1.1.
Tableau 4 :Effets des conditions de culture (≤emp‘rature, dur‘ee d'incubation et milieux de cultures) sur l'identification bact‘rienne par MALDIBiotyperTM (2 Tableaux)
E. coli P. aeruginosa S. aureus Streptococcus pneumoniae H. influenzae Listeria monocytogenes Neisseria mucosa Score 1ère ID Score 2eme ID Cultures fraiches (18H) 2.453 2.487 2.440 2.032 2.132 2.243 2.231 2.422 2.404 2.339 1.986 2.108 2.115 1.764 (N. macacae) ≤e m p‘ ra tu re 37 °C 18 + 6H 2.257 2.289 2.234 1.915 1.944 2.056 2.214 2.087 2.255 2.226 1.801 1.895 2.032 1.782 18 + 30H 2.339 2.343 2.358 2.191 2.029 1.986 2.187 2.095 2.267 2.339 1.840 1.906 1.951 1.997 (N. macacae) 18 + 54H 2.327 2.271 2.329 2.012 2.027 2.085 2.139 2.007 2.191 2.328 1.831 2.018 2.062 1.871 a m b ia n te 18 + 6H 2.357 2.484 2.422 1.972 2.186 2.158 2.218 2.275 2.367 2.350 1.830 2.029 2.052 1.988 (N. macacae) 18 + 30H 2.288 2.348 2.373 1.845 2.052 2.155 2.212 2.159 2.244 2.259 1.769 2.026 2.046 1.838 (N.macacae) 18 + 54H 2.321 2.470 2.384 1.856 2.169 2.068 1.917 2.233 2.360 2.365 1.762 2.166 2.037 1.869 4° C 18 + 6H 2.412 2.489 2.503 2.007 2.140 2.252 2.185 2.359 2.289 2.433 1.979 2.112 2.159 1.936 (N. macacae) 18 + 30H 2.289 2.357 2.344 1.995 2.105 2.117 2.001 2.157 2.157 2.301 1.889 2.087 2.089 1.934 18 + 54H 2.205 2.251 2.352 1.865 2.073 2.127 2.011 2.002 2.225 2.298 1.789 2.029 1.975 1.875 (N. macacae)
Milieux de cultures Souches test‘es
E. coli Pseudomonas aeruginosa S. aureus Listeria monocytogenes Haemophilus influenza Score 1ere ID / Score 2eme ID
G‘lose chocolat 2.479 2.406 2.360 1.411 2.384
2. 315 2.400 2.301 1.305 2.050
G‘lose Columbia + 5% sang 2.465 2.445 2.291 2.043
2.403 2.238 2.252 1.997
G‘lose Mueller Hinton 2.451 2.452 2.341 2.329
2.353 2.322 2.306 2.302
Drigalski 2.429 2.453 2.216 2.405
G‘lose chocolat + Bacitracine 2.089
1.965
Hueller Hinton + 5% sang 2.295