Les techniques de biologie mol‘culaire ont boulevers‘ l'identification des bact‘ries, et ont mis en lumière les insuffisances et les erreurs d'identifications ph‘notypiques qui ‘taient jusque là seules disponibles[58] [45] .
L'identification mol‘culaire des bact‘ries repose essentiellement sur l'analyse de la s‘quence du gène ARNr 16S. La s‘quence obtenue au laboratoire est compar‘e via le r‘seau internet, à l'aide de logiciel sp‘cialis‘ avec les banques ‘lectroniques de s‘quences constitu‘es par GenBank (Nucleotide) :
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide), en Europe (http://www.ebi.ac.uk/), qui sont des banques publiques que l'on peut consulter librement sur internet, ou bien des banques commerciales.
L'identification bact‘rienne va reposer sur le pourcentage de similarit‘ des s‘quences. On admet g‘n‘ralement, qu'une similarit‘ de 99% est identifiante au niveau de l'espèce. ≥ne similarit‘ de 97% identifiante au niveau du genre et qu'en dessous de 97%, il y a une possibilit‘ de nouvelle espèce non d‘crite dans les banques de donn‘es. Par ailleurs, certains logiciels permettent de positionner la s‘quence obtenue au laboratoire parmi l'ensemble des s‘quences ARNr 16S disponibles sous forme d'arbres phylog‘n‘tiques[59] [60] [61] [62] [63] . Cette possibilit‘ est particulièrement int‘ressante lorsque l'on d‘termine au laboratoire une s‘quence ARNr 16S de similarit‘ inf‘rieure à 97%; cela permet alors d'avoir une id‘e du groupe bact‘rien dans lequel se situe la bact‘rie nouvellement identifi‘e[64] .
L'identification mol‘culaire des certaines bact‘ries peut ‘galement ’tre r‘alis‘e grâce à l'analyse de la s‘quence du gène rpoB. L'analyse de cette s‘quence vient en compl‘ment de l'analyse de la s‘quence du gène ARNr 16S pour un certain nombre de groupes et de genres bact‘riens comme les mycobact‘ries, pour lesquelles le gène 16S ARNr est peu discriminant[65] . On peut noter ‘galement le s‘quençage du gène sodA pour les Streptocoques groupes oraux.
L'identification mol‘culaire des bact‘ries est utile dans plusieurs cas de figure : elle est utile pour les bact‘ries fastidieuses de croissance lente, parmi lesquelles se trouvent ‘videmment les bact‘ries intracellulaires, qui sont souvent des bact‘ries d'identification difficile exprimant peu de caractères ph‘notypiques, mais ‘galement le cas de certains genres bact‘riens cultivant en milieu ax‘nique comme les mycobact‘ries. Elle est ‘galement utile lorsque l'identification ph‘notypique n'est pas performante (cas des Acinetobacter, exprimant très peu de caractères ph‘notypiques) ou dans le cas ou il existe une discordance entre cette identification ph‘notypique et la sensibilit‘ aux antibiotiques par exemple. Elle est enfin utile pour toutes les souches bact‘riennes qui sont isol‘es dans une circonstance inhabituelle pour laquelle il convient absolument de confirmer l'identification. La dernière application concerne le
contrôle de l'identification des souches qui sont reçues des laboratoires ext‘rieurs, y compris des collections de r‘f‘rence, et montre qu'il y a un taux d'inexactitude qui est compris entre 0.5 et 2%[45] .
4.1. ≤ypage mol‘culaire des bact‘ries
Le typage mol‘culaire des bact‘ries vient en compl‘ment des investigations ‘pid‘miologiques r‘alis‘es en cas de suspicion de cas group‘s ou d'‘pid‘mie. L'id‘e g‘n‘rale est de d‘montrer que diff‘rentes souches appartenant à la m’me espèce bact‘rienne forment un clone c'est-à-dire qu'elles sont toutes issues d'une bact‘rie source commune. L'identification pr‘cise des isolats au niveau de l'espèce est donc un pr‘-requis indispensable. Plusieurs m‘thodes ont ‘t‘ d‘velopp‘es qui peuvent ’tre sch‘matiquement r‘parties en deux groupes :
4.1.1. ≤ypage mol‘culaire par analyse de profils
Le premier groupe des m‘thodes, le plus souvent utilis‘ actuellement, repose sur l'analyse de profils d'ADN chromosomiques ou de fragments d'ADN chromosomiques color‘s par des bases intercalantes fluorescentes comme le bromure d'ethidium ou bien par des sondes marqu‘es avec un fluorochrome. Les bandes ainsi visualis‘es r‘sultent soit de la restriction des acides nucl‘iques par des enzymes de restriction : c'est par exemple la m‘thode de
pused field gel electrophoresis (PFGE) qui repose sur la restriction de l'ADN chromosomique total par des endonucl‘ases à faible fr‘quence de coupure. La migration des gros fragments d'ADN obtenus sur des gels d'agarose n‘cessite un appareillage d'‘lectrophorèse particulier[66] , et la coloration des bandes obtenues par du bromure d'ethidium. Un autre exemple, est celui du g‘notypage d'une mycobact‘rie en utilisant une hybridation d'une sonde qui reconnait la s‘quence d'insertion IS6110, celle-ci est hybrid‘e sur l'ADN chromosomique total extrait des bact‘ries. ≥n deuxième groupe de m‘thodes permet d'obtenir des profils d'amplification, il s'agit d'une façon g‘n‘rique de PCR al‘atoires qui utilise de tous petits oligonucl‘otides comme amorces d'amplification et qui vont amplifier au hasard des r‘gions de chromosome. La technique d'ERIC-PCR est un exemple de typage mol‘culaire par analyse de profil d'amplification appliqu‘e aux ent‘robact‘ries[1] [45] .
Une autre modalit‘ de g‘notypage repose sur l'analyse de profil d'amplification correspond ant à l'amplification d'‘l‘ments r‘p‘t‘s à l'int‘rieur des g‘nomes. En effet, l'analyse des g‘nomes complets a montr‘ que la pluparts des g‘nomes bact‘riens poss‘daient des r‘gions r‘p‘t‘es et que le nombre de r‘p‘tition ‘tait variable d'une souche à l'autre à l'int‘rieur de la m’me espèce. ≥n produit d'amplification ciblant ces r‘gions r‘p‘t‘es aura donc une taille directement proportionnelle au nombre de r‘gions r‘p‘t‘es et il est ainsi facile de visualiser sur un simple gel d'agarose ces diff‘rentes longueurs et les diff‘rents profils correspondant
aux diff‘rentes souches. Cette technique est actuellement une technique de r‘f‘rence pour le g‘notypage de Mycobacterium tuberculosis par amplification des VNTR (variable number of tandem repeat)[67] [68] , encore appel‘s dans le cas particulier Mycobacterium tuberculosis
des MIRU (Mycobacterial interspersed repetitive units). La technique des VNTR a par ailleurs ‘t‘ appliqu‘e à d'autres pathogènes comme Yersinia pestis[69] et Chlamydophila psittaci[70] .
Quelques soit la technique, l'analyse des profils de restriction ou d'amplification repose sur l'hypothèse que les souches appartenant au m’me clone vont donner le m’me profil de restriction ou d'amplification. Cependant, ces techniques sont lourdes à mettre en uvre, elles requièrent souvent beaucoup de mat‘riel g‘n‘tique pour les techniques de restriction, ce qui est particulièrement laborieux pour des microorganismes particulièrement fastidieux ou des microorganismes particulièrement pathogènes comme l'agent de tuberculose. Par ailleurs, pour certaines bact‘ries, ces profils de restriction ne peuvent pas ’tre utilis‘s du fait de leur instabilit‘ lorsque l'on r‘alise des sous-cultures des bact‘ries et c'est par exemple le cas de
Yersinia. Enfin, de façon g‘n‘rale, ces techniques sont mal standardis‘es, il n'est pas directement possible de comparer les r‘sultats obtenus d'une exp‘rimentation à l'autre et de telles comparaisons requièrent des logiciels d'analyse d'images sophistiqu‘s.
4.1.2. ≤ypage mol‘culaire par s‘quençage
≥n deuxième groupe de techniques a ‘t‘ très r‘cemment d‘velopp‘ qui repose sur le s‘quençage ou le quasi s‘quençage de fragments g‘nomiques. Concernant le quasi s‘quençage, c'est l'analyse des single nucleotides polymorphism (SNP) qui est une nouvelle technique de g‘notypage des bact‘ries qui est utilis‘e de façon r‘cente pour les
Mycobacterium tuberculosis. Elle repose sur le fait que certaines positions des r‘gions codantes ou non codantes du g‘nome admettent un certain degr‘ de variabilit‘ donnant lieu à ces polymorphismes sur un seul nucl‘otide. Les SNP peuvent ’tre analys‘s de façon avantageuse en utilisant le pyros‘quençage. ≥ne deuxième m‘thode repose sur le s‘quençage de gènes codants pour des enzymes (dit gènes de m‘nage, housekeeping genes). Cette m‘thode de multiple variable locus analysis (MVLA) est en fait l'adaptation mol‘culaire de la technique ph‘notypique d'analyse des variants enzymatiques[71] .
D'autres techniques ont ‘t‘ d‘velopp‘es r‘cemment comme la technique multispacer sequence typing (MS≤). Elle repose sur le s‘quençage des spacersqui sont les r‘gions non codantes s‘parant les gènes dans le chromosome des bact‘ries[72] [73] . La technique a ‘t‘ appliqu‘e avec succès à des bact‘ries consid‘r‘es comme très homogènes sur le plan phylog‘n‘tique pour lesquelles aucune m‘thode de g‘notypage n'‘tait actuellement disponible, comme Coxiella burnetii[73] , Bartonella henselae, Bartonella quintana, Francisella tularensis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia conorii et Yersinia pestis[74] [75] [76] .
4.2. D‘tection mol‘culaire de la r‘sistance aux antibiotiques
Il est possible de d‘tecter la pr‘sence de gènes codant une r‘sistance aux antibiotiques, comme le gène mecA codant la r‘sistance à l'oxacilline chez les Staphylococcus aureus.
Plusieurs trousses de d‘tection mol‘culaire de ce gène sont maintenant commercialis‘es. Il est ‘galement possible de d‘tecter des mutations associ‘es à une r‘sistance comme les mutations de gène rpoB codant la sous-unit‘ b’ta de l'ARN polym‘rase et dont certaines mutations regroup‘es dans une petite r‘gion, sont associ‘es à la r‘sistance à la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus et certaines ent‘robact‘ries et
Rickettsia[77] [78] [79] [45] .