M odifications post-trad uctionnelles des histones

a. D éfinition d es marq ues histones

D ’une manière générale , les nucléosom es em pêch e nt la transcription de l'AD N en réduisant son access ibilité aux facteurs nucléaires nota mm ent par obstruction p hysique, ou par flexio n de l'AD N [Luger et al., 1997] lo rsq u’ils so nt e n gra nd e d ens ité. Les histones composa nt les n ucléosom es peuvent com porte r de nombreus es modifications post-trad uctionnelles (PT Ms) pouvant influence r la com paction ou l'accessibilité de la chromatine par d ifférents m écanism es [Law rence et al., 2016]. Class ique me nt, ces PTMs com pren ne nt l'acétylation, la m éthylation, la phosphorylatio n, l'ubiq uitinylatio n, la sumoylation, l’AD P ribosylation et la désamination [K ouzarides, 2007]. Le d épôt d e l’ens em ble d e ces modifications des histones étant orchestré par un ense m ble d e fam illes d’e nzym es (Figure 12). Plus récem me nt, d'autres modifications, te lles que la propionylation e t la butyrylation, ont égale me nt été décrites [ K ebede et al., 2015]. L es m odifications post-trad uctionnelles des his tones actuelle m ent bien connue s concerne nt p rincipalem e nt le ur région N-terminale, correspondant à la queue des histones, c’est-à-dire les acid es am inés access ibles à la s urface du nucléosom e, co m m e pa r exe m p le les Lysines 4, 9, 14, 23, 27, 36 de l’histo ne H 3, ou encore les Lysines 5, 8, 12, 16, 20 de l’histone H 4 [Luger et al., 1997].

Fig ure 12 | Les voies d e m odifications post-trad uctionnelles des histones. Ces voies de modification des histones incluent la phosphorylation d 'histidine (P) par des kinas es de protéines (PK), pouva nt être éliminées par des p hosphatases de protéines (PP). L'ubiq uitine et des protéines s imilaires (Ubl) peuvent être ajoutées aux histones (e n particulier H2A et H2B) par des voies d’ubiq uitinatio n rég ulées par les p rotéines SUMO . C es m odifications p euve nt être réve rsées p ar d es protéases spécifiq ues d e l'ubiq uitine (USP). La méthylation des histones (Me) au niveau des arginines et des lysines peut être effectuée par différe ntes classes d'histone méthyltransférases (H MT ), et certaines marques de méthylation pe uve nt être annulées par des déméthyla ses spécifiques des histone s (H SD ). L'acétylation (Ac) d es lysines des histo nes est régulée par d iverse s histones acétyltra nsféras es (HAT ) et p eut-être éliminée par des histones d ésacétylases (H D AC). Certaines H D AC peuve nt égale m ent fonctionner dans le cad re de la ribosylation d es histones. D ’après [Rider Jr et al., 2010].

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En plus des queues des histones, les do m aines glo b ulaires des histones p euve nt aussi recevoir un certain nom bre de m odifications post-trad uctionnelles [Cosgrove et al., 2004 ; T ropb erger et Schneid er, 2013]. Ces domaines globulaires forme nt le noyau du nucléosom e, e t leur partie externe en contact direct avec l'AD N prése nte un intérêt particulier vis-à-vis d e l’étude d es m arques pouvant modifie r ces régions d u nucléosom e. La spectro m étrie de m as se a perm is d'ide ntifier d e nouvelles PT Ms touchant le domaine globulaire d u nucléosom e [ Cerbo et al., 201 4].

b. Modes d ’action des marq ue s histones

Certaines m odifications ap portées aux acides am inés composant les queues de s histones affectent directem e nt les interactio ns entre les nucléosom es. C ’est par e xe mple le cas d ’H 4K 16ac qui réd uit la com paction de la chrom atine [S hogren-K naak et al., 2006], et par conséquent au gm ente la transcriptio n d es gènes à la fois in vitro et in vivo. Le dépôt de la marque H4 K1 6ac est ca talysé par la protéine MO F, égalem ent nom m ée K AT 8, codée par le gène males absent on the first (mof), tout d’a bord ide ntifié da ns le génom e d e D . m elanogaster, p uis retrouvé par ho mologie d e séq uence a u sein d u géno me d e nom b reux m a mmifères. MO F est une histone ace tyl transfe rase (H AT ) [ H ilfik er et al., 1997] com po rtant un d om aine de fixation su r la chromatine (C hro matin Bind ing D om ain). Elle est impliquée da ns la com pe nsation de dose chez D . m elanogaster e n s’intégrant au com plexe protéique Male Se x-Le htal (M SL). Chez les mam mifères, ce tte protéine est une sous-unité du comp lex e Non-Specific-L ethal (NSL), co ntrôlant l’initiation d e la tra nscription d e no mb re ux g ènes do m es tiq ues et mitochondria ux [ Me ndja n et al., 2006 ; Cai et al., 2010 ; Prestel et al., 2010 ; Raja et al., 2010 ; Lam et al., 2012 ; Feller et al., 2012].

Concerna nt les m odifications post-traductionnelles touchant la partie globulaire d es histones, certaines p euve nt avoir de s effets directs sur la trans cription comm e H 3K 122a c. Les Lysines 115 et 122 des histones H3 ont toutes deux été id entifiées comm e de nouveaux sites d’acétylation au niveau de la surface latérale d u nucléosome e ntra nt e n contact avec l’AD N, correspo nda nt plus particulière me nt à l’endroit où la force de liaison entre AD N et histone est la plus forte [Cocklin et W ang , 2003 ; Hall et al., 2009 ; Manohar et al., 2009]. Le dépôt de cette m arque est catalysé par la Bromodo main protein 4 (BRD 4) par un m éca nism e inconnu. Cette HAT est par exem ple im pliq uée dans le dévelo ppem ent d e cancers et dans certaines maladies auto-imm unes chez l’H om me [D evaia h

et al., 2016]. H3 K122ac co-localise avec des marq ues caractéristiques des gènes actifs (H3K 4m e3) et des enha nce rs (H3 K4 me 1 et H 3K27ac) [T ropberg er et al., 2013]. H 3K 122ac est ainsi retrouvée enrichie au niveau de régions pa uvres en nucléosomes et pro ches des T SS où les nucléosomes sont absents afin d’initier la transcription. Ces résultats sont plus que sim ple me nt corrélatifs , puisqu’il a été montré qu’H3 K122ac prom eut l’éviction des nucléosom es et augme nte la transcription d e manière d irecte lors d’e xpérime ntations in vitro [T ropbe rg er et al., 2013 ; T ropbe rge r et Schneid er, 2013]. D ans le cadre de l’induction de l’e xp ress ion d e gènes par l’œ stro gène, la marque H 3K122ac est déposée en m oyenne 10 minutes après ajout d’œ strogène com paré à la marque H3K 4m e3, (po urta nt considérée com m e une marque histone inhérente à l’activation de la tra nscription des gènes) d éposée au m ieux 30 à 40 minutes ap rès ajout d’œ strogène [T rop berger et al., 2013]. La ma rq ue H 3K1 22ac touchant la partie

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globulaire du nucléosom e pourrait ainsi constituer à l’avenir un nouvea u contrôle de l’activité des gènes, pouva nt être plus p récis d’un point d e vue te mporel que les m arques histones actuelle me nt utilisées da ns ce domaine.

D ’autres m arques pe uvent qua nt à elles agir de ma nière indirecte sur la structure de la chro matine par le recrutem ent de protéines régulatrices. Ces dernières pe uve nt par exem ple bloq uer l'accès aux com ple xes de re m odela ge [Marg ue ron et al., 2005], ou influencer le recrute me nt de modificateurs de la chromatine ou d es facteurs de tra nscriptio n [Vettese-D ad ey et al., 1996 ; Clem e nts et al., 200 3]. C’est notam me nt le cas de la reconnaiss ance d’H 3K 9m e3 par Hete rochrom atin Protein 1 (HP1) dans le cadre de l’inhibitio n de la transcription d ’élém ents rép étés [Lehne rtz et al., 2003].

c. Métho des d ’études

Les m arq ues histones sont principalem ent étudiées grâce à l’imm uno précipitation de la chromatine (ChIP) [T urner, 2001], aujo urd’hui générale me nt couplée à du s équenç a ge haut-débit (C hIP -seq ) ou d e la PC R quantitative . La m éthode C hIP p ermet, à l’aid e d’a nticorps dirig és co ntre des m odifications post-trad uctionnelles d’histone, d’im m unoprécipite r l’AD N as socié à ces histones modifiés , o u encore d’étudier les sites d e fixations de p rotéines se liant à l’AD N (comm e les facteurs de tra nscription. Il existe plusieurs types de p rotocoles perm etta nt de cond uire une ChIP , principalem ent la XC hIP et la Native ChIP (NChIP) [T urner, 2001]. Ces deux tech niq ues diffère nt principale me nt dans la prép aration de la chrom atine avant imm unoprécipitatio n et présentent chacu ne de s avantages et des inconvénients.

La XC hIP est bas ée tout d’a bord s ur une lyse cellulaire puis sur une fixatio n d e l’A D N aux protéines du nucléosom e par du forma ldéhyde , c’est-à-dire la formation de liaisons covalentes entre ces deux éléme nts à l’aid e de form aldéhyde. C ette éta pe est suivie d’une frag m e ntation de l’AD N par sonication. Cette m éthod e prése nte les avantages d e pouvoir étudier à la fois des protéines histones et non-histones, re quiert une plus faible qua ntité de ce llules que le NC hIP, et perm et de minimiser les risques de réarrange me nts de la chromatine au cours d e la préparatio n de la chromatine et de sa précip itation, l’AD N et les nucléosom es étant « figés » par des liaisons covalentes créées par le formald éhyde. En revanche, la fixation au form aldéhyd e pe ut entraîner l’enrichisseme nt d ’évènem e nts de fixation transitoires , impliq uant donc la détection de faux positifs lors des analyses en aval des données issues d e X ChIP.

D ans le cas du NChIP, l’éta pe d e cross linking est omis e ce qui p erm et la prépa ration de la chro m atine native pour une fragm enta tion de l’AD N par digestion enzymatiq ue après une lyse cellulaire . Le NChIP prése nte l’avanta ge d’une s pécificité sans doute accrue des protéines reconnues par les anticorps, la plupart d’entre e ux éta nt dirigés contre d es protéines non-fixées au form aldéhyde. E n outre l’im m unop récipitatio n donne généralem ent des re ndeme nts bien supérieurs au XC hIP, évitant de ce fait le recours à des étape s d’am plification. En revanche, le NChIP n’est applica ble q u’a ux p rotéines histones, p rése nte des pos sibilités de réarrange me nt de la chrom atine au cours de l’e xpérime ntation et donc des résultats potentiellem e nt m oins rép étable s. Enfin la fragmentatio n d e l’AD N par digestion

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enzym atiq ue pe ut être séle ctive envers certaines séquences de la chromatine, qui peuvent alors être surre présentées [T urne r, 2001].

d. Combinaison de marq ues e t états chromatinie n

Au sein des génom es eucaryotes, différe nts états chromatiniens coexiste nt et sont définis notam me nt par des co m binaisons d e m arques histones. Par exe m ple chez D . m elanogaster, 9 états chrom atiniens ont été d éfinis à l’aide de l’étude d e 18 m arques histones. Ces d ernières ont égaleme nt été co rrélée à d’a utres données génom iq ues, com m e la position d’autres protéines no n-histones co mme les FT , les régio ns accessibles de la ch romatine par D NaseIse q, la cartographie d es transcrits naissants par G RO -seq, ou encore les longs et petits ARN non-codants [K harchenko et al., 2011]. L’ense m ble de ces informatio ns a permis de dresse r une carte génomique et épigénétiq ue com plète d u génome de la D rosophile, p ermetta nt d e distinguer les caractéristiques des différents éléme nts du génom e (chrom oso m es , gènes , éléme nts régulateurs et d’autres domaines fonctionnels). Le premier état chrom atinie n le plus distinct est ass ocié aux rég ions transcriptionnellem ent active s et proches des T SS et des promoteurs, enrichi en m arques histones actives telles que H3K 4m e2/3 et H3K 9ac. L’activité d’élo ngatio n des ARN est qua nt à elle asso ciée à l’e nrichisse m e nt d e la ma rq ue H 3K 36 me3 a u sein d’un 2

nd

état chromatinie n retrouvé préférentielle me nt au nivea u des régions exoniques des gènes transcrits. Le 3

èm e

état chromatinien es t retro uvé particulière m ent au nive au d es régio ns introniques et se distingue par l’e nrichissem ent des marques H3K 27ac, H3K 4m e1 et H 3K 18ac. Le 4

èm e état chrom atinie n est appare nté au 3

èm e

avec un enrichiss eme nt d’H 3K 36me1 et une déplétion d ’H3K 27ac au niveau d es régions introniq ues. Le 5

èm e

état chromatinien est retrouvé sp écifiquem ent sur le chrom osom e X et se distingue pa r l’e nrichiss em e nt élevé de la marq ue H 4K 16a c, accompagné d ’un enrichissem ent d e la marque H 3K3 6m e3, ainsi que d’autres marq ues ap partena nt au 2

èm e état chrom atinie n « d ’élongatio n ». C e 5

èm e

état chromatinien est notam me nt retrouvé au niveau du s eul chrom osom e X des cellules m âles et est ass ocié au mécanis m e d e com pe nsation de dose retro uvé chez ces derniers [Larscha n et al., 2007]. Le 6

èm e

état chromatinie n es t caractérisé par des répress ions de la transcriptio n par de s com plexes Polycom b et l’enrichisse m e nt de la ma rque H 3K 27me3. L es domaines hétérochromatiniens p érice ntro m ériques et le chro m osom e 4 so nt q ua nt à e ux caractérisés par un enrichiss e me nt de s marq ues répress ives H3K 9me2 et H 3K 9m e3, co ns tituant le 7

èm e état chrom atinie n d u géno me d e la D rosophile [Eiss e nb erg et Reuter, 2009]. L e 8

èm e

état chromatinie n es t égale me nt ass ocié aux marques H3K9 me 2/m e3, m ais es t retrouvé particulièreme nt au niveau du chrom osom e X [Eiss enberg et Reuter, 2009]. Enfin, le 9

èm e

état chromatinie n est caractérisé par des états silencieux de la chrom atine p rése nta nt l’enrichissem ent d es marq ues histone H 3K 27me3 et H3K 23ac, sépa rant divers clusters de chro m atine ouverte.

Les m arq ues histones ainsi que leurs fonctions ayant globale me nt été conservées au cours de l’évolution, certains d e ce s états chromatinie ns sont retrouvés chez d’a utres organis m es com me l’H om me , où une étud e plus précise a perm is l’identification de 51 états chromatiniens au travers du génom e humain [Ernst et K ellis, 2010]. Par exem ple 11 états chromatiniens de l’H omm e partag ent d e fortes similitudes avec l’état chromatinien 1 du génom e de D . melanogaster concernant les régio ns

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prése ntant une activité transcriptionnelle im portante accompagn ée d ’un e nrichis sem e nt d’H 3K 4me3. Chez la plante m odèle A. thaliana, 42 états chromatiniens ont d’abord été ide ntifiés [Luo et al., 2013], puis réduits au nombre de neuf [Seq ueira -M ende s et al., 2014], co mme chez D . melanogaster. Concerna nt la ma rq ue H 3 K 4m e3 par e xe mple, pa rm i les neuf états chrom atiniens chez A. thaliana, deux prése nte nt un e nric hissem ent d ’H 3K 4me 3 au niveau d es sites d’initiatio n de la transcription [Seq ueira-Me ndes et al., 2014]. En comparant ces états chromatiniens entre esp èces, il est possible de définir avec précision la conservation des caractéristiq ues de différe ntes modifications post-traductionelles d es histones, notam me nt en te rm e d e positionnem ent d ans le génom e vis-à-vis d es unités transcriptionnelles e t régulatrices (Figure 13).

Fig ure 13 | D istrib ution des e nrichissem e nts de m arques histones le long d ’un gène actif et inactif. Le gène tra nscriptionnelle me nt actif prése nte des histones caractéristiques qui co localisent avec l’ARN polym érase II (RNAPII), comm e H 3K 4m e 2, H 3K 4m e1, H 3K4m e3 et H 3K9ac. D es marques ass ociées à l’élongation d ’ARNm sont égalem e nt prés entes dans le corps du g ène actif com me H 3K 79m e1, 2 et 3. Les co mbinaisons de m a rque H3K 9m e2/3 , H 4K 20me3, H 3K 27me3 et un faible enrichiss em e nt d’H 3K 4m e3 sont caractéristiques d’un gène inactif. Adapté d’a près [Barth et Im hof, 2010].

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5. Structure tridim ensionnelle de la chromatine : définition et

m éthodes d ’étude s

Au-delà d e sa structure bidim ensionnelle, la chro m a tine possèd e des structures d’ord re supérieur (Figure 14) com m e une organisation spatiale tridimensionnelle au s ein d u noyau. In vitro, la structure primaire de la chro m atine correspond à une organisation en « collier de p erles », où s’enchainent AD N libre et nucléosom es, o bse rvable au m icroscope électroniq ue o u à force atomiq ue da ns d es solutions possédant d e faibles forces ioniques [O lins et O lins, 1974 ; D aban, 2011]. D ans des s olutions contena nt des cations divalents com me M g2+, cette structure primaire s’a rrange d e m anière spontanée e n une structure secondaire plus dense, c orres po nda nt à la fibre de chromatine d e 30nm de diam ètre [T homa et al., 1979 ; W idom, 1986]. D ’autres structures secondaires p euve nt être form ées à l’aide de protéines « architectes » non-histones comm e les protéines nucléaire s dites ‘’High Mobility G roup’’ (H MG N) ou les pro téines du groupe Polycom b (PcG ) [Luger et Ha nsen, 2005]. Sous certaines conditions physiologiques, ces structures secondaire s peuve nt se replier en une structure tertiaire formant des fibres de 100 à 130nm de diam ètre [Belmo nt et Bruce, 1994 ; Hanse n, 2002]. Ces structures peuvent e nfin se compacter sous forme de chromosom es m étap hasiq ues.

Fig ure 14 | Les structures d’ordre supérie ure de la chromatine, de l’AD N a u chromosome de m éta phas e. L’AD N (1) est compacté sous form e de chromatine à l’aid e d es nucléosomes formant une structure « en collier de p erle » d e 11 nm d e dia mètre (2). C ette fib re se replie selon une structure secondaire e n solénoïd e o u en zigzag de 30 nm de diamètre (3). Cette s tructure secondaire se re plie ensuite en une structure tertiaire de faç on enco re inconnue, consituant un chromosom e en interphas e (4). Enfin, cette s tructure tertiaire se replie e n un ch romosom e m éta phas ique (5).

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Au sein d u noyau, la structure tridim ens io nnelle d e la chromatine perm et de m ettre e n co ntact des régio ns pourtant très éloignées d’un m ême chrom osome, voire des régions de différe nts chrom osom es, e n form a nt des do maines topologiq ueme nt ass ociés (T AD s), permetta nt une mise en place efficace de la régulation transcriptio nnelle de no mbreus es régio ns parfois d istantes de p lusie urs millions de nucléotid es [Nora et al., 2012]. Un T AD est défini co m m e une régio n montra nt des niveaux élevés de contacts entre le s séque nces d’AD N au sein de cette régio n, et de faibles contacts, à longue ou courte distance, avec les régions voisines [Pombo et D illon, 2015]. Les T AD s pre ndraie nt la form e de boucles stables, définies par les protéines C T CF et cohésines [Steve ns et al., 2017].

Les T AD s ont été étudiés à l’aide de métho des de ca pture de la co nformation des chromosomes com me le 3C [D e kk er et al., 2002] dont d e nom b re use s variantes existent, com m e par exem ple le plus réce nt H i-C [Lie berma n-Aide n et al., 2009]. Le principe général d u 3C est basé sur une fixation au formald éhyde (cross-linking) de ce llules suivie d’un isolem e nt et d’une purification de la chromatine, suivie enfin d e sa dig estion par une e nzyme d e restriction. Pour le 3C , les e nz ymes utilisées s ont choisies afin de cibler des contacts AD N-AD N entre deux régions d’intérêt et d’e n libérer les fragm ents [D ekk er, 2006]. Plusie urs p aramètres so nt à consid ére r afin d e choisir la bo nne e nzym e de restriction, notam me nt la résolution à laquelle on veut cartog rap hier les contacts et la distribution ho mogène des sites de coupure de l’AD N par l’enzym e de restriction au sein de la région étudiée [Naumova et al., 2012]. Les fragm ents ains i libérés sont ensuite ligués en annea ux, puis la fixation au form aldéhyd e est annulée (reverse cross-linking). Cette étap e de liga tion est suivie d’une PCR quantitative afin de déte rminer l’a bondance d es prod uits d e ligatio n a près purification de l’AD N. L’abo nda nce ainsi mesurée correspo nd directeme nt à la fréquence d’interaction d es de ux régio ns liguées . C e p rincip e peut être couplé à d’autres m éthodes com m e du séquenç ag e afin d’en augm e nte r le débit ou l’échelle . Avec la méthod e H i-C [Lieb erm a n-Aid en et al., 2009], l’étape de ligatio n imp liq ue l’ajout d’un nucléotide marqué à la vitamine B (biotinylé) à la jonction de la ligation, permetta nt ainsi une p urification sélective des prod uits de ligation, suivie d’un séquenç age haut-d ébit [Belto n et al., 2012]. Ce couplag e aux tech nologies NG S permet au H i-C d ’e xplorer sans a priori et à l’échelle d u géno m e e ntier les interactions e ntre l’ens em b le des régio ns du génom e à l’aide de matrices de co ntact (Figure 15). C ette exh austivité d e l’H i-C vis-à-vis des autres m étho des d e capture de la co nformation des chro m osom es, telles que le 4C (Circula rized Chromosom e Conformation Capture ) ou le 5C (Carbon Copy Chromosom e C onformatio n C apture), perm et d’explorer à la fois les propriétés biophysiq ues d e la chrom atine et les implications biologiques des structures tridime nsionnelles de la chromatine au sein du noyau [Belton et al., 2012]. En outre, les fragme nts d’AD N issus du Hi-C ont été m ontrés comm e particulière me nt adaptés à l’ass em blage d e génom es de novo [Bickhart et al., 2017 ; D udchenko et al., 2017], ou à l’am élioration ou la co rrection de l’ass em blage de génom es prée xistants. U ne étude Hi-C à l’éch elle d u géno me d e la souris a ainsi identifié 2200 T AD s occupant 91% du g énome, avec une taille moyen ne d e 880k b [D ixon et al., 2012]. C ette étude a aussi m ontré que les frontières des T AD s sont