Acce ss ibilité de la chro matine

a. Access ibilité de la chromatine à l’échelle bidim e nsionnelle

D es expérie nces dans les années 1970 ch ez le canard et le poulet ont montré, respectivem ent p ar hybridation ARN-AD N ou p ar digestion à la n ucléase, des de grés d e compaction différe nts de l’AD N euca ryote lors d e com pa raison de régio ns génomiq ues activem ent tra ns crites et de régions transcriptio nnelle me nt silencieus es [Axel et al., 1973 ; W eintra ub et G roudine , 1976]. La chrom atine est ainsi une structure permetta nt non s eule m ent d e co ndens er l’ens em ble d ’un génom e e ucaryote au sein du noyau, mais aussi de moduler localem ent l’accessibilité de l’AD N pour sa transcription, sa reco mbinaison, sa réparation et sa réplication [Venka tes h et W orkma n, 2015]. B ien que la structure des nucléosomes puisse paraître rigid e d’un point de vue cytologique , la position de ces unités constituantes d e la chroma tine est dyna m ique et permet d e mod eler la com paction de la chromatine [Radma n-Livaja et Ran do, 2010]. O n p eut disting uer l’euch rom atine , co rres po nda nt à des régio ns access ibles et transcrites, e t l’hétérochro m atine, d ens e et transcriptionnelle me nt silencie use [Luger et al., 2012 ; Milon et al., 2014]. Il existe bien évide m me nt des états chromatiniens interm édiaires et flexibles pour les quels l’acces sibilité de la chro matine et la transcription sont régulées pa r différents mécanis m es . Un d es méca nismes p ermetta nt cette fluidité de la chro m atine est l’échange d ’histo nes, impliqua nt la suppression ou le remplace me nt par le jeu de différents types de variants d’histones. C e mécanis m e d’échange , aussi connu sous le nom « d’histone turnover », a diverses im plications dans la com position, la structuration ou la fonction de différentes régio ns génom ique s. Par exem ple , une augm e ntation d u ta ux d’échange d es histones pe ut a ug me nter l’accessibilité d’une régio n génomique à certains facteurs nucléaires comm e la RN AP II, perm ettant de fait la transcriptio n de cette régio n. En revanche, si ces histones s ont re m placées par d es variants pouvant bloq uer ce m éca nism e d’écha nge , alors l’accessibilité et la transcription de cette région diminuera [T alb ert et H enikoff, 2010 ; Ve nkatesh et W orkma n, 2015], com m e c’est par exe mple le ca s de l’histo ne macroH 2A activeme nt déposé sur le chrom osom e X inactif et conde nsé d es mam mifères en re mplac em ent d es histones H2A [Costanzi et Pehrson , 1998] (d étaillé e n II.C ). Ces changem ents d’a cces sibilité peuve nt égalem ent être régulés par des protéines rég ulatrices considérées co mme des facteurs pionniers à l’origine d e cascades de rég ulation com m e Forkhead box protein A1 (FO XA1, a us si connu s ous le nom HN F3α) [Zaret et Carroll, 2011]. Ces p rotéines s ont sup posées s e lier à l’AD N associé aux nucléosomes et recrute r des facteurs nucléaires additio nnels afin de m odifie r la compaction de la chrom atine. D e manière ad ditionnelle, ces facteurs pionniers p euv ent re ntrer e n com p étition avec les nucléosom es pour la liaison à l’AD N et ainsi aug me nter l’access ibilité de la chromatine [Miller et W idom , 2003 ; Mirny, 2010].

D es change me nts dans la structure d e la chromatine ont été m o ntrés com m e impliqués da ns de nom bre ux processus biologiqu es, y compris da ns certains dysfonctionne m e nts cellulaires. Chez l’H om me par exe m ple, d e s m utations au niveau d e gènes codant pour des facteurs nucléaires modeleurs de la chromatine, et affectant la positionnem ent des nucléosome s, se sont révélées impliquées da ns la formation de ca ncers [G as par-Maia et al., 2009 : 1 ; Hargreav es et Crabtree , 2011 ; Schwa rtze ntrube r et al., 2012]. Il peut donc être intére ss ant de com parer d es pro fils d’accessibilité de

II. Synthèses b ibliographiq ues B. Mécanism es ép igénétiq ue s e t structure d e la chrom atine

la chromatine à l’échelle de géno mes entiers d e cellules placées dans différe ntes conditio ns afin d’ide ntifier les régions différe ntiellem ent ouvertes accom pag nant le dévelop pem e nt de maladies , la différe nciation de cellules ou encore l’intégration de signaux environne me ntaux [T sompana et Buck, 2014]. D e grands projets collaboratifs co mme ENC O D E [Consortium, 2012] ont ainsi large me nt participé a u dévelo pp em ent de ces profils chrom atinie ns et des m éthodes p erm ettant de les étudier.

b. Métho des d ’études

L’analyse de la structure e t de la dynam iq ue de la chrom atine est possible grâce aux avancées e n génom iq ue et à l’accès à des génom es séque ncés et ass em blés. Plusieurs techniques perm ette nt une analyse bidime nsionnelle de la structure d e la chro matine, en décrivant les régions ouv ertes (AD N access ible) ou ferm ées (AD N non-access ible). C o nce rn ant l’a nalyse d e la ch romatine ouv erte , d éplétée en nucléosom es, il existe le D Nase-seq [W eintra ub et G roudine, 1976 ; Song et Crawford , 2010 ; John

et al., 2013], le FAIRE-se q [Nagy et al., 2003 ; G iresi et al., 2007 ; G iresi et Lie b, 2009 ; Simon et al., 2012 , 2013] et l’AT AC-seq [Buen rostro et al., 2013b, 2015], tandis que le MNase-se q perm et l’étude la position des nucléosom es , et donc des régions ferm ées de la chromatine [Noll, 1974 ; C ui et Zhao, 2012 ; Rizzo et Sinha, 2014 ; T sompana et Buck, 2014]. Bien q ue ces techniq ues repose nt sur des principes de biologie moléc ulaire différe nts, elles p ermette nt d’ide ntifier d es rég ions en com m uns en plus d e régions sp écifique s à chaque m éthod e. La descriptio n rapide ainsi q ue les avanta ges et inconvénients d e ces m éthodes so nt présentés dans le T ableau I. La m éthode FAIRE ayant été large m e nt utilis ée a u cours de m a thèse, une d escription plus poussée d e cette m éthod e est p roposée en Matériel et M étho des (III.)

c. Identification d’éléme nts régulate urs par l’étude de l’ac cessibilité de la chromatine

L’utilisation de ces méthodes perm et d’une part d’étudier les restructuratio ns de la chromatine à l’éch elle d u génom e, et d’a utre part l’ide ntification d’élém e nts régulate urs putatifs tels que les enhance rs, ou d’une ma nière plus générale les sites putatifs de fixation de facteurs de transcription (T FBS). C eci est rendu possible du fait de la co rrélation positive entre l’accessibilité de la chrom atine et la présence d e T FBS, l’AD N devant être access ible pour permettre la reconnaiss ance et la fixation du FT sur le motif d’AD N qui lui est as socié.

I I . S y n t h è s e s b i b l i o g r a p h i q u e s B . M é c a n i s m e s é p i g é n é t i q u e s e t s t r u c t u r e d e l a c h r o m a t i n e 3 3 Tab leau I O u t i l s a c t u e l s d ' ét u d e d e l' a c c e s s i b i l i t é d e l a c h r o m a t in e à l ' é c h e ll e d u g én o m e ( a d a p t é d e T s o m p a n a e t B u c k , 2 0 1 4 ) N o m b r e d e c e l l u l e s T y p e d e s é q u e n ç a g e A p p r o c h e u t i l i s ée C i b l e g én o m iq u e C o n s i d ér a t i o n s e x p ér i m e n t a l e s R éf ér e n c e s

1. De nom b reuses cellules so nt nécessaires

2. Tit rat io ns enzy matiques labo rieuses

3. Dégrad e les régions régulat rices act iv es, ren dan t leu r ident ificat io n po ssib le seulement d e m anière indirect e

4. Deman de 150 à 200 millions de lect ures pou r u ne ét ude standard du géno me hum ain

1. De nom b reuses cellules so nt nécessaires

2. P réparat ion lon gu e et co mplex e des éch ant illo ns

3. Tit rat io ns enzy matiques labo rieuses

4. Deman de 20 à 50 millions de lect ures pou r u ne ét ude standard du géno me hum ain

1. F aible rat io sign al/bruit , rend ant difficile l'int erp rét at io n des do nnées bioinformat iques

2. L es résult at s dépendent grand em ent de l'efficacit é d e fix at ion au fo rm aldéhy d e

3. Deman de 20 à 50 millions de lect ures pou r u ne ét ude standard du géno me hum ain

1. Cont aminat io n des do nnées par de l'ADN mit och on drial

2. Out ils d 'analy se bioinformat ique en core im mat ures

3. Deman de 60 à 100 m illio ns de lect ures p our u ne ét ude standard du géno me hum ain

ATAC: assay fo r t ransposase-accessible chromat in; DN ase I: deox y rib onu clease I; F AIR E: fo rm aldehy d e-assist ed iso lat io n of regulat o ry element s; M Nase: micrococcal nu clease. A T A C - s e q 500 à 500 000 cellules fraichem ent isolées Paired -end

Des no y au x no n fix és sont t aggé in v it ro av ec d es adapt at eurs pou r N GS au n iv eau de région s accessib les p ar un t ransposase Tn5 pu rifiée

Carto grap hie de la chromat ine ouv erte, d es fact eurs d e t ranscrip t ion et d es nucléosomes Buenrostro et al., 2013 Giresi et al., 2007 ; Giresi et L ieb , 2009 ; Simon et L ieb, 2009 ; Simo n et al., 2013 ; Simon et al., 2013 ; N agy et al., 2003 D N a s e - s e q 1 à 10 million de cellules Paired -end ou Single-end

L a DN ase I cou pe l'ADN au niv eau de régions accessib les o ù l'ADN n'est p as prot égé et permet l'ext ract ion d e chro mat ine ou v ert e

Carto grap hie de la chromat ine ouv erte

W eint raub et Gro ud ine, 1976 ; Son g et al., 2010 ; Jo hn et al., 2013 F A IR E - s e q 100 000 à 10 millions de cellules Paired -end ou Single-end

L e F AIRE est basé sur la créat ion de liaiso ns co v alent es ent re ADN et nu cléosom es grâce au fo rmaldéhy d e, puis sur une séparat ion d e l'ADN ouv ert son iq ué d e l'hét érochromatine par ex t raction au p hén ol-ch lo ro fo rm e

Carto grap hie de la chromat ine ouv erte

N oll, 1974 ; Rizzo et Sinha, 2014 ; Cui et Zhao, 2012 M N a s e - s e q 1 à 10 million de cellules Paired -end ou Single-end

L a M N ase digère l'ADN au n iv eau de sit es situ és d e part et d 'aut re des nu cléo so m es, permet tant d'ex t raire l'ADN lié à ces comp lex es prot éiq ues

Carto grap hie l'ensemb le des n ucléosome d u génom e de manière q ualit at iv e et q uant it at iv e

II. Synthèses b ibliographiq ues B. Mécanism es ép igénétiq ue s e t structure d e la chrom atine

Le FAIRE-seq et le MAINE-seq ont par e xem ple été utilisés chez le parasite res ponsable d u paludis m e chez l’H om m e , Plas modium falciparum, un parasite protozoaire au géno m e riche en AT [Ponts et al., 2010]. Chez cet organism e, et comparative m ent aux eucaryotes non-p rotozaires, les facteurs d e transcriptio n sont re prése ntés com pte tenu d e la taille d u génom e, et le s mécanis m es sous-jacents ass ociés à la régulation de la transcription sont controversés. Les m éthodes d e FAIRE-se q, permettant d ’e xtraire les régions libres de nucléoso m es , et de MAINE-se q, pe rm etta nt l’e xtraction de l’AD N as socié aux nucléosomes, ont donc été mis es en œ uvre afin d’étudier l’im plication d es mod ulations de l’accessibilité de la chrom atine e n rela tion avec la régulation d e l’exp ression d es gènes au cours du cycle d’infection de ce parasite. Il a été m ontré q ue l’accessibilité globale de la chro matine subit d es change me nts d rastiques au cours d u cycle de vie d u parasite, contras tant avec les modifications plus ciblées d e l’accessibilité de la ch rom atine chez les e ucaryotes non-p rotozoaires. Par exe m p le, l’access ibilité glo bale d e la chromatine a ug m e nte au cours du cycle d e vie de P. falciparum après leur invasion des globules rouges, p uis se compacte à nouvea u avant le déb ut du prochain cycle. L’occupation des prom oteurs par les nucléosom es au niveau local suit ces modifications globales d ’acces sibilité d e la chromatine, avec cependant d es exce ptions a u niveau des gènes var impliqués da ns la virule nce d u pa rasite. Ces rés ultats montre nt q ue les process us dirigea nt l’express ion des gènes chez Plas modium falciparum sont différents de ceux d écrits chez les euca ryotes no n-protozoaires, im pliquant ici des restructuratio ns globales d e la chromatine au co urs du cycle de vie de ce protiste [Ponts et al., 2010].

Le FAIRE-se q et l’AT AC -seq ont égale m ent été utilis ées dans le ca dre de l’ide ntification de T FBS et d’e nhance rs lors du développe m ent de tum eurs in vivo chez l’H omm e [D avie et al., 2015]. 3778 régio ns prése ntant une chrom atine ha ute me nt acces sible au cours du dévelop pe me nt d’une tume ur ont ainsi été identifiées comm e suractivées. L’application de métho des bioinform atiques de recherche de motifs a ensuite permis l’ide ntification d’un enrichissem e nt de la fixation putative de deux facteurs transcriptio n au nivea u d e ces régions : Stat92E et AP-1. L’utilisatio n d’un m utant Stat92E a e nsuite résulté e n un sauvetag e d u phénotyp e tumoral. Cette étude démontre que l’utilisation de méthodes de séq ue nç age des régions accessibles de la chromatine, couplées à des méthodes bioinformatiq ue de reche rche et d’enrichisseme nt d e m otifs constituent un moyen efficace po ur id entifie r les éléme nts rég ulate urs du g éno me tels que d es enhance rs ou des silencers [D avie et al., 2015].

II. Synthèses b ibliographiq ues B. Mécanism es ép igénétiq ue s e t structure d e la chrom atine