Chapitre 6. Evaluation des propositions
6.2 Méthodologie
II.3.1CONSTRUÇÃO DE MUTANTES DE DELEÇÃO DO cDNA DO HDV
Para construção de uma série de mutantes com dimensões progressivamente menores do cDNA do HDV utilizou-se um kit comercial, Erase-a-Base System (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. Este sistema, que se baseia na estratégia desenvolvida por Henikoff (1984), utiliza a exonuclease III (Exo III) para digerir unidireccionalmente sequências de DNA de cadeia dupla. A Exo III cataliza a remoção sequencial de nucleótidos a partir das extremidades 3’-OH recessivas ou cegas das moléculas de DNA de cadeia dupla. Por outro lado, as extremidades 3’-OH com 4 nucleótidos protuberantes são resistentes à digestão pela Exo III. Dadas as propriedades catalíticas da Exo III, o sentido da digestão é, facilmente, controlado por dupla hidrólise enzimática do DNA de interesse com endonucleases de restrição, em que uma das enzimas gera uma extremidade 3’-OH recessiva ou cega, susceptível à digestão pela Exo III, e a outra origina uma extremidade 3´-OH protuberante, resistente à acção da Exo III.Para além de ser possível controlar o sentido da digestão, a actividade de exonuclease 3’→5’ da Exo III é constante e dependente da temperatura, sendo a taxa de remoção de nucleótidos tanto maior, quanto maior for a temperatura da reacção.
A digestão unidireccional do cDNA do HDV foi efectuada a 25ºC, prevendo-se para esta temperatura uma taxa de digestão de 90 a 100 nucleótidos por minuto.
O DNA molde utilizado na construção dos mutantes de deleção do cDNA do HDV foi o do plasmídeo pDL542. Este plasmídeo contém uma cópia completa do cDNA do HDV acrescida de uma repetição de 161 bp, clonada no vector de expressão eucariota pSVL (Figura II.3.1; Lazinski and Taylor, 1994). Na sequência do cDNA do HDV foi efectuada uma deleção de 2 bp que interrompe a grelha aberta de leitura do S-HDAg. Como resultado, após transfecção de células eucariotas com o plasmídeo pDL542, são produzidas moléculas de RNA genómico do HDV, sob controlo do promotor tardio do vírus SV40, incapazes de se replicar (Lazinski and Taylor, 1994).
Para a construção dos mutantes de deleção do cDNA do HDV, começou-se por digerir 10 µg de DNA plasmídico, com as enzimas de restrição BoxI e SacI (Fermentas). A endonuclease SacI
reconhece, somente, um local de restrição no plasmídeo pDL542 (5’-GAGCT↓C-3’), na posição 1938, a dois bp a montante do local de início da sequência do cDNA do HDV. Esta enzima de restrição gera extremidades 3’-OH com 4 nucleótidos protuberantes resistentes à acção da Exo III. A enzima de restrição BoxI cliva o plasmídeo pDL542 na posição 2159, a 219 bp a jusante do local, onde se inicia a sequência do cDNA do HDV. Ao contrário da endonuclease SacI, a BoxI, cuja sequência de reconhecimento é 5’-GACNN↓NNGTC-3’ (N representa qualquer um dos 4 nucleótidos), origina extremidades cegas que são susceptíveis à digestão unidireccional pela Exo III.
Da digestão dupla do plasmídeo pDL542 com as enzimas SacI e BoxI foram obtidos dois fragmentos, um com 6029 e outro com 221 bp. Os fragmentos de restrição foram separados por electroforese em gel de agarose low melting point 2% e a banda de maior dimensão foi removida do gel. A extracção do DNA foi efectuada pelo método fenol-clorofórmio-álcool isoamílico, seguida da precipitação do DNA com etanol (Sambrook et al., 1989).
Após precipitação, o sedimento de DNA foi ressuspenso em 10 µl de tampão TE (10 mM Tris- HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA). Ao DNA dissolvido foi adicionado tampão da Exo III (66 mM Tris- HCl, pH 8.0, 0.66 mM MgCl2), até um volume final de 60 µl e 400 U de Exo III. Esta mistura foi, então, incubada a 25ºC, tendo-se procedido à recolha, minuto a minuto, de 2.5 µl da reacção (cerca de 200 ηg de DNA) para 17 tubos contendo 7.5 µl de uma mistura com nuclease S1. Finalizadas as digestões unidireccionais com a Exo III, os 17 tubos com fragmentos do plasmídeo pDL542, com tamanhos progressivamente menores, foram transferidos do gelo para a temperatura ambiente, para permitir a digestão das caudas de DNA de cadeia simples resultantes da digestão com Exo III, por acção da nuclease S1. Após 30 minutos de incubação, procedeu-se à inactivação da nuclease S1, por aquecimento a 70ºC durante 10 min.
Posteriormente, os DNAs foram precipitados com 0.3 volumes de acetato de amónia 7.5M e dois volumes de etanol absoluto. Depois de secos, os sedimentos de DNA foram ressuspensos em 9 µl de tampão TE e incubados com 0.1U de fragmento Klenow da DNA polimerase I e 0.05 mM de dNTPs. Finalmente, após o preenchimento das extremidades das moléculas de DNA, adicionou-se 40 µl de uma mistura contendo 0.2 U de T4 DNA ligase. Uma hora depois, as misturas de ligação, contendo os mutantes de deleção do cDNA do HDV recircularizados, foram utilizadas para transformar bactérias competentes E. coli JM109.
A selecção de plasmídeos, com o tamanho esperado para cada tempo de digestão com a Exo III, foi efectuada por restrição enzimática com a endonuclease HindIII (Fermentas), seguida da análise por electroforese em gel de agarose. Os vectores em que o cDNA do HDV apresenta
dimensões próximas das previsões teóricas foram sequenciados recorrendo, para isso, aos serviços de sequenciação da empresa STAB VIDA.
Resolvidas as sequências, estas foram alinhadas, utilizando-se ferramentas informáticas apropriadas como o MultAlin (multiple sequence alignment; Corpet, 1988). Do alinhamento das sequências foi possível determinar a extensão da deleção do cDNA do HDV como resultado da digestão com a Exo III. Na figura II.3.1.1 apresenta-se o esquema geral utilizado na construção dos mutantes de deleção do cDNA do HDV, acima descrito.
Figura II.3.1.1. Representação esquemática do plasmídeo pDL542 e da estratégia baseada na utilização da Exo III para construção de mutantes de deleção do cDNA do HDV.