5. Techniques de biologie moléculaire
5.1. Méthodes d’extraction des acides nucléiques
Extraction de l’ADN génomique à partir de culture
L’ADN génomique des bactéries est extrait et purifié à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN
génomique, Wizard Genomic DNA purification kit (Promega). Ce kit permet l’obtention
rapide d’ADN génomique de bonne qualité utilisable en biologie moléculaire et pour le
séquençage de génomes.
Pour extraire l’ADN génomique d’une bactérie, une culture est réalisée puis collectée en
fin de phase exponentielle de croissance par centrifugation à 10000g pendant 5 min, puis le
surnageant est éliminé. Le culot est alors repris dans 600 µL d’une solution d’EDTA 50 mM à
pH 8 contenant 10 mg/mL de lyzozyme et mis à incuber 1 H à 37 °C pour dégrader les parois
bactériennes. Après cette étape, les cellules bactériennes se trouvent à l’état de
protoplastes. Une nouvelle centrifugation à 10000g est réalisée pendant 2 min, puis le
surnageant est éliminé et le culot est repris dans 600µL de tampon de lyse (Nuclei Lysis
Solution). Le tube est alors incubé à 80°C pendant 5 min pour lyser les cellules, puis il est
ramené à température ambiante. Le mélange est alors traité avec 3µL de RNase A et placé à
37°C pendant 30 min pour éliminer les ARN. Après retour à température ambiante, 200 µL
de solution de précipitation (Protein Precipitation Solution) sont ajoutés au mélange puis
homogénéisés à l’aide d’un vortex pendant 20s, pour précipiter tous les débris cellulaires. Le
mélange est ensuite placé dans la glace pendant 5 min, puis centrifugé à 10000g pendant 3
min. Le surnageant est alors transféré dans un tube contenant 600 µL d’isopropanol.
Plusieurs mélanges par retournement permettent de précipiter l’ADN. Une centrifugation
permet d’éliminer l’isopropanol, puis le culot est lavé à l’éthanol à 70%. Une dernière
centrifugation et un séchage pendant 15 min permettent d’éliminer toute trace d’éthanol.
Le culot est alors repris dans 20 µL d’eau ppi (pour préparation injectable) et placé à 4°C
pendant une nuit pour être réhydraté.
Extraction de l’ADN génomique à partir de vin
Ce protocole est utilisé pour extraire l’ADN total des microorganismes présents dans un
échantillon de vin. Le même kit d’extraction d’ADN, cité précédemment, est utilisé. Des
modifications ont été apportées au protocole pour optimiser l’extraction d’ADN à partir du
vin.
Un échantillon de 10 mL de vin est centrifugé à 10000g pendant 5 min pour concentrer
la biomasse. Après élimination du surnageant, le culot est ensuite délicatement repris dans
300 µL de tampon TE à pH 8 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Après centrifugation, le surnageant
est éliminé et le culot est remis en suspension dans 300 µL d’une solution d’EDTA (50 mM
pH 8). Le mélange est alors transféré dans un tube à vis contenant 200 µL de billes de verre
(0,1 mm de diamètre). Le tube est placé dans un homogénéisateur à haute vitesse FastPrep
(MP Biomedicals) qui va permettre une lyse mécanique des cellules en effectuant un cycle
de 45 s à une vitesse de 6,5 m/s. Les tubes sont ensuite immédiatement placés dans de la
glace pendant 1 min pour les réfrigérer. Ces deux étapes sont répétées 5 fois, puis 300 µL de
tampon de lyse (Nuclei Lysis Solution) et 200 µL de solution de précipitation (Protein
Precipitation Solution) sont ajoutés au mélange. Le tube est vortexé pendant 20 s, puis placé
dans la glace pendant 5 min, avant d’être centrifugé à 10000g pendant 3 min. Le surnageant
est transféré dans un nouveau tube et une solution de PVP à 10% (Polyvinylpyrrolidone) est
ajoutée à 1% du volume final pour éliminer les composés phénoliques. Le mélange est
ensuite vortexé pendant 10 s, puis centrifugé à 10000g pendant 2 min. Le surnageant est
transféré dans un tube contenant 500 µL d’isopropanol et le tube est mélangé plusieurs fois
par retournement puis il est maintenu à température ambiante pendant 15 min. L’ADN est
précipité par une centrifugation à 10000g pendant 15 min. L’isopropanol est éliminé et le
culot est lavé par ajout de 300 µL d’éthanol à 70%. L’éthanol est ensuite éliminé après
centrifugation et le culot est séché comme précédemment. La réhydratation est réalisée en
ajoutant 20 µL d’eau ppi et 0,6 µL de RNase A au culot, qui est placé à 4°C pendant une nuit.
Extraction de l’ADN génomique sur carte FTA Whatman
Les cartes FTA Whatman sont une technologie d’extraction, de purification et de
conservation d’ADN à partir de matrices diverses. Le principe est simple, il suffit de déposer
une goutte d’échantillon sur un emplacement de la carte qui contient tous les composés
chimiques nécessaires à la lyse cellulaire, la dénaturation des protéines et la protection de
l’ADN vis-à-vis des nucléases, de l’oxydation et des rayons ultraviolets. L’ADN est fixé sur la
matrice qui peut être directement utilisé en biologie moléculaire et peut se conserver pour
de longues périodes à température ambiante.
Cette technique a été utilisée pour des vérifications lors des congélations dans l’azote
liquide et des repiquages successifs de souches. Pour réaliser les dépôts, les cultures de
souches pures sont diluées au ½ et les cultures concentrées avant congélation dans l’azote
liquide sont diluées au 1/10
èmeavant dépôt de 7 µL sur la carte. La carte est ensuite séchée
Séquence cible Amorce séquences (5'-->3') Amplicon (pb) Références
Identification des espèces
ADN ribosomique 16S BSF8 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1500 Edwards et al., 1989
BSR 1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
Séquences répétées en tandem
Lipoprotéine PlpE like (également utilisée pour identification d’O. oeni)
TR1f GGTAAGGGAAAAGTTATCCTCG
79 - 511 Claisse et al., 2012
TR1r GTTTTACCTTCGGTCGAGC
Protéine kinase TR2f CATAATAGAATTCACTTCGCTTACC 203 - 863 Claisse et al., 2012
TR2r GTAGCTGGTACGAGCTCTTC
Protéine à domaine LysM TR3f CTAATTCTTCCTCGCCCTTTG 379 - 967 Claisse et al., 2012
TR3r GGACTGACTGTACTTATTTGAGG
Transporteur ABC TR4f GTGACCGACCAAAGCATAAC 0 - 150 Claisse et al., 2012
TR4r AAAAACGCTCCAAGAAAGGT
Carboxypeptidase membranaire TR5f AAATCCTGGTTTTGTCCGTA 83 - 101 Claisse et al., 2012
TR5r GGCTTCCTATCCATTTTGGT
Gènes spécifiques groupe A/B
cell surface protein precursor 405f GTGGTTCCGGTCTTTTTGTCTG
405 Campbel-Sills et al., 2012
405r TCAAGTTGTGTCTCCTGCCC
Protéine hypothétique 469f ACATTTGCCGATACCAGGCA
469 Campbel-Sills et al., 2012
469r AGTCGATGTGTAAATCACGTTCT
Gènes des voies d'altération
hdc HDC3 GATGGTATTGTTTCKTATGA3
435 Coton et al., 2010
(Histidine decarboxylase) HDC4 CCAAACACCAGCATCTTC
tdc TDC2 ACATAGTCAACCATRTTGAA
1133 Coton et al., 2010
(Tyrosine decarboxylase) TDC5 CAAATGGAAGAAGAAGTAGG
odc ODC1 NCAYAARCAACAAGYNGG
900 Coton et al., 2010
(Ornithine decarboxylase) ODC2 GRTANGGNTNNGCACCTTC
agD AgD1 CAYGTNGAYGGHSAAGG
600 Coton et al., 2010
(Agmatine déiminase) AgD2 TGTTGNGTRATRCAGTGAAT