5. Techniques de biologie moléculaire
5.5. Génotypage de SNP grâce au kit iPLEX Gold de Sequenom
Le principe du génotypage multiplexé par analyse de SNP grâce au kit iPLEX Gold
(Sequenom), repose sur l’amplification simultanée de 40 fragments contenant un SNP, suivi
d’une extension d’amorce permettant d’amplifier uniquement le SNP d’intérêt.
L’identification des SNP est réalisée par la suite grâce à un spectromètre de masse de type
MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization- time-of-flight mass spectrometry)
(Figure 11). Cette méthode étant haut débit, il est possible d’analyser plusieurs centaines
d’échantillons à moindre coût et de manière assez rapide. Elle est beaucoup utilisée en
analyse biomédicale et pour l’étude des bactéries pathogènes. Toute les étapes du
génotypage, du design des amorces jusqu’à l’export des résultats, ont été réalisées à la
plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux (cgfb). Chaque étape se déroule dans une
pièce et avec du matériel dédiés pour diminuer au maximum les risques de contamination.
Critères de choix des SNP et design d’amorces
* Choix des SNP : Une liste de SNP spécifiques des groupes phylogénétiques de l’espèce
O. oeni a été établie par comparaison des core génomes de souches appartenant au même
groupe phylogénétique (Hugo Campbell-Sills, communication personnelle). Une présélection
de SNP est réalisée en vérifiant la présence du SNP sur un gène présent en une seule copie
sur le chromosome. L’absence de SNP à moins de 100 pb de proximité est vérifiée par
alignement et comparaison des séquences des gènes contenant le SNP. Seuls les SNP non
synonymes sont conservés.
* Design d’amorces : Les SNP sélectionnés ainsi que leurs séquences flanquantes, sont
transmis à la plateforme de génotypage qui se charge de dessiner les amorces. Le logiciel
MassARRAY Assay Designer (Sequenom) dessine 2 types d’amorces : 1/ des amorces avec
une queue 10-mer, utilisées pour la PCR d’amplification des fragments contenant les SNP, 2/
des amorces utilisées pour la réaction iPLEX d’extension d’amorce. Le logiciel sélectionne les
couples d’amorces compatibles avec la réalisation d’une PCR multiplex avec, dans notre cas,
40 couples d’amorces. Au final 40 SNP sont choisis et 40 x 2 couples d’amorce sont dessinés.
Le logiciel génère aussi le fichier contenant les différentes masses en fonction des bases
incorporées lors de la réaction iPLEX. Cela permettra au logiciel, lors de l’analyse par le
spectromètre de masse, de déterminer la nature des bases incorporées. Les différentes
amorces, ainsi que les différents produits d’extension avec leur masse, sont indiqués dans
l’annexe 7.
Amplification des SNP grâce au kit iPLEX Gold
La réaction d’amplification des SNP par le kit iPLEX Gold se fait en 4 étapes, permettant
d’obtenir au final des produits PCR désalinisés contenant uniquement des amorces avec leur
extension SNP (Figure 11).
* 1 ère étape : Amplification d’un fragment d’environ 100 pb contenant le SNP grâce à
des amorces possédant une queue 10-mer. Une réaction PCR multiplex est réalisée avec un
mix PCR contenant les 40 couples d’amorces sélectionnés. La réaction se déroule dans une
plaque PCR 384 puits contenant les ADNs des échantillons à analyser, ainsi qu’un contrôle
positif du mix et un contrôle négatif. Le programme PCR est celui d’une PCR classique, avec
une étape initiale de dénaturation de 2 min à 95°C suivie de 45 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à
56°C, 60 s à 72°C, et une étape finale d’élongation de 5 min à 72°C.
* 2 ème étape : Neutralisation des dNTPs non-incorporés. La réaction est réalisée en
ajoutant aux produits PCR de la phosphatase alcaline « SAP » (Shrimp Alkaline Phosohatase),
qui permet de cliver les phosphates des dNTPs, pour éviter toute interaction lors des étapes
suivantes. La réaction est réalisée par incubation de 40 min à 37°C, suivi d’un cycle de 5 min
à 85°C.
* 3 ème étape : Réaction iPLEX. Elle correspond à une PCR qui permet l’extension
d’amorce d’une seule base qui correspond au SNP. Les amorces ont été dessinées de telle
sorte qu’elles vont s’hybrider de façon adjacente au SNP d’intérêt. Cette réaction est
réalisée en ajoutant dans les produits PCR précédents, un nouveau mix PCR contenant les 40
couples d’amorces d’extension et des nucléotides dont la masse a été modifiée. Le
Figure 12. Dispositif Sequenom pour le génotypage par SNP. a) Nanodispenser, transfert les produits
d’extension d’amorces sur une micropuce SpectroCHIP. b) MassARRAY Analyser, spectromètre de masse qui
va analyser les produits d’extension d’amorces par MALDI-TOF.
a) b)
Trafic light Pourcentage de réussite d’affiliation de SNP pour chaque puit Cluster plotVisualisation des résultats par SNP Chaque point correspond à l’allèle d’un échantillon
Spectre de masse de chaque SNP pour chaque échantillons Signalisation du SNP