Métabolisme énérgetique

3.3.1. Analyse NADH/NAD par séparation en HPLC et détection UV254 nm

Principe : Le couple redox des cofacteurs NAD+/NADH, H⁺ est mesuré après séparation par CLHP couplée à un détecteur UV/Visible

Préparation des Tissus

• Peser 10 mg de chaque échantillon ou standards (0-100 µM NADH/NAD⁺)

• mettre en suspension dans 500 µL de Tampon de lyse (475 µL acide citrique 50 mM, phosphate de sodium 100 mM, pH 4,5 (NaOH) + 20 µL DTT 0,5 M + 5 µL SDS 10%).

• Extraire les composés en appliquant 3 cycles de congélation (azote liquide) et décongélation (37°C) des échantillons

• incuber les échantillons dans une cuve à ultrasons pour 15min/4°C avant d’ajouter 500 µL Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) (sous hotte aspirante) en agitant à la main pendant 1 min.

• Centrifuger à 12000g/4°C/10 min

• récupérer la phase aqueuse (supérieure, ~ 450 µL) et ajouter 500 µL Chloroforme.

• Centrifuger à nouveau à 12000g/4°C/10 min, récupérer la phase supérieure (aqueuse) dans des microtubes noirs et stocker les échantillons à -20°C jusqu'au début de l'analyse NAD/NADH.

Analyse chromatographique :⁽¹⁾

• dépôt d'échantillon : 50 µL

• Symmetry Waters, C18, 5 µ, 150x3,9 mm, 0,6 mL/min, 135bar, 10µLInj, 30°C, FL-340/460

• 80 bar, 10µL Inj, 30 °C, UV-254

• (1). Solutions pour la phase mobile :

• Solution A : Citric acid 50 mM, NaH2PO4 100 mM, pH 4,5 (NaOH)

3.3.2. Analyse ATP/ADP/AMP et AMPC par séparation en HPLC

Principe:les dérivés de molécules adénylées (ATP, ADP, etc.) sont mesurés par fluorescence

après dérivation des molécules puis séparation par HPLC. Les nucléotides portant des groupements adenyl sont séparés par HPLC en phase inverse et analysés suite à une dérivation fluorescente du résidu adényl.

Préparer les Tissus

• Diluer 10 mg de tissu dans 100 µL de PBS 1x contenant 1% d’EDTA 0,5 M.

• Faire 3 cycles de congélation (azote liquide) et décongélation (37°C)

• Doser la concentration de protéines à l’aide du kit BCA.

Procédure

• Ajouter 500 µL du mélange de solvants Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) aux échantillons et agiter à la main pendant 1 mn pour

• Eliminer les protéines. Après centrifugation à 12,000g/4°C/10 min.

• Récupérer la phase aqueuse (supérieure, ~450 µL)

• ajouter 100 µL de chloroforme.

• Centrifuger à nouveau à 12,000 g/4°C/10 min

• Récupérer 40µL de phase aqueuse (supérieure)

• transférer dans des microtubes noirs.

• Ajouter ensuite 40 µL d’acétate de sodium 1M et 4 µL Chloroacétaldéhyde ~50% (attention, très toxique).

• Incuber les échantillons à 80°C pendant 20 min dans un bon chauffant, puis refroidir dans la glace.

Les échantillons sont stockés à -20°C jusqu'au début de l'analyse.

Procédure de séparation et d’analyse par HPLC ⁽¹⁾ Matériel :

- Pompe à haute pression P1000XR, 0,8 mL/min (~85 bar)

- Déposer 50 µL dans les inserts pour flacons d’échantillonneur automatisé AS100, - injecter 10 µL dans la colonne

- Colonne Nova-Pack (Waters) C18, 60A, 4 µ, 150x3, 9 mm

- Détecteur à fluorescence Shimadzu RF10AXL, réglé à 278 nm (Ex) / 418 nm (Em), sensibilité de niveau 2, gain de niveau 2 et range de niveau 0

Intégrateur : logiciel Borwin 3,1

Les pics ainsi identifiés sont quantifiés à partir d’une gamme de standards, et les concentrations calculées sont rapportées à la concentration de protéines totales ou la concentration de tissu.

(1). Solutions pour la phase mobile :

- A – Citric Acid 50 mM, NaH2PO4 100 mM, pH 4,5

3.3.3. Peptides natriurétiques

Le NT-proBNP a été testé sur de plasma EDTA- par immunochemiluminescence avec un automate Elecsys™ 2010- (Roche-Diagnostic, Meylan, France), comme décrit [66] et le BNP par l’automateTriage® BNP immunoassay (Societé Alère, France).

3.3.4. Marqueurs du stress cellulaire (ALAT/ASAT)

Le dosage de l’Alannine AminoTransférase (ALAT) a été réalisé selon la méthode de Henry [318] et Bergmeyer [319]. Le principe de la méthode consiste à mesurer l’activité enzymatique de l’ALAT à partir de 2 réactions successives. La première transforme la L-alanine en pyruvate via l’ALAT, la seconde permet la transformation du pyruvate en L-lactate en utilisant comme co-facteur le NADH. La diminution de l’absorbance due à la conversion du NADH en NAD⁺, proportionnelle à l’activité ALAT dans l’échantillon, est mesurée à 340 nm. Le dosage de l’Aspartate AminoTransférase (ASAT) est réalisé selon la méthode développée par Henry [318]. Comme pour le dosage de l’ALAT, Le principe de la méthode consiste à mesurer l’activité enzymatique de l’ASAT à partir de 2 réactions successives. Le premier produit à partir du L-Aspartate, du L-Glutamate et de l’oxaloacétate via l’ASAT, la seconde permet la transformation de l’oxaloacétate en L-mactate en utilisant comme co-facteur le NADH. La diminution de l’absorbance due à la conversion du NADH en NAD⁺, proportionnelle à l’activité ASAT dans l’échantillon, est mesurée à 340 nm.

Les mesures sont réalisées avec un automate multiparamètrique, Olympus AU 2700 (Beckman Coulter, France). 12 µL de résume pour le dosage de l’ALAT et 12 µL pour le dosage de l’ASAT. Ces dosages ont été réalisés en collaboration avec le laboratoire de biochimie biologie moléculaire nutrition et métabolisme du CHU de Nancy-Brabois.

3.3.5. Dosage Radio-Immunoassey de l’insuline⁽¹⁾

Principe : Le dosage radioimmunologique dépend de la capacité d'un anticorps à se lier à son antigène. Pour quantifier l'antigène, les formes radioactives et non radioactives de l'antigène sont en compétition pour les sites de liaison sur un anticorps spécifique. Plus l’antigène non radioactif est présent, moins l'antigène radioactif va se lier à l’anticorps.Dans le dosage de l'insuline ImmuChem™, l'anticorps est lié de façon covalente à la surface intérieure d'un tube en polypropylène. Ainsi, le complexe antigène-anticorps lié est également lié à la paroi du tube. Il n’y a pas de deuxième anticorps, de charbon actif ou tout autre agent précipitant nécessitant une centrifugation. À la conclusion de l'essai, l'antigène libre est aspiré ou décanté. La radioactivité [¹²⁵I] liée à l’anticorps, inversement proportionnelle à la quantité d’insuline non-radioactive, est ensuite mesurée à l’aide d’un compteur gamma. L’insuline dans les échantillons est déterminée graphiquement à partir d’une courbe de standards d’insuline. Les dosages ont été effectués sur des échantillons de plasma à l’aide du coffret commercial ⁽¹⁾.

Préparation des réactifs

Reconstituer le lyophilisat d’insuline-[¹²⁵I] avec 5,0 mL d’eau distille et laisser 60 min à température ambiante

Procédure de dosage

• Numéroter 14 tubes pour la courbe étalon et 2 autres pour les contrôles positifs et négatifs. A partir du numéro 17, numéroter 2 tubes supplémentaires pour chaque échantillon

• Ajouter les étalonset les échantillons conformément aux indications données dans le tableau suivant : Tubes 1,2 3,4 5,6 7,8 9,10 11,12 13,14 15,16 17, … Etalons ou échantillons 100 µL Standard1 100 µL Standar2 100 µL Standard3 100 µL Standard4 100 µL Standard5 100 µL Standard6 100 µL Standard7 100 µL control 100 µL échantillons Description 0 µLU/mL 5,5 µLU/mL 15 µLU/mL 35 µLU/mL 70 µLU/mL 175 µLU/mL 330 µLU/mL control µLU/mL plasma

• Ajouter 900µl de solution active de marquage dans chaque tube y compris les tubes 1 et 2.Agiter les tubes au vortex

• Incuber à TA ambiante (≈ 21°C) pendant 18 h

• Décanter avec précaution et jeter le surnageant. Retirer la dernière goutte en posant les tubes sur du papier absorbant

• Laver chaque tube avec 4mL l’eau distille

• Aspirer de l’eau et sécher les tubes avec papier absorbant

• Mesurer la radioactivité des tubes vides, l’un après l’autre à l’aide d’un compteur

gamma⁽²⁾. 1 minute pour chaque échantillon

• calculer les résultats avec la formule %B/B0 =

(1) ImmuChem^TM Coated Tube Insulin ¹²⁵I RIA Kit, (MP Biomedicals, LLC)

(2) COBRA-II^TM autogamma (Packard) à double canal

3.3.6. Dosage du glucose

Le mesure a réalisée avec un automate multiparamètrique Olympus AU 2700® (Beckman-Coulter, France). Ce dosage a été réalisé en collaboration avec le laboratoire de biochimie biologie moléculaire nutrition et métabolisme du CHU de Nancy-Brabois