1. Analyse protéomique du myocarde
L’analyse protéomique a montré qu’il y avait 8 protéines avec changements significatifs par rapport à leur abondance. Ces protéines sont impliquées dans le métabolisme énergétique et elles sont en relation avec PPAR-α et PGC-1α. Parmi ces protéines nous avons trouvé que l’acyl-CoAdehydrogénase à chaîne courte (SCAD), l’aldose reductase (AKR1B), la NADH déhydrogénase 1α sous-unité 10 (ubiquinone) (NDUFA10) et la NADH déhydrogénase (ubiquinone) flavoprotéine-2 (NDUFV2) diminuent leurs expression chez les ratons soumis au régime carencé de 42, 25 17, 34 et 20 % respectivement (Figure 31).
Témoin Carencé Témoin Carencé
Figure 31. Analyse protéomique de quelques protéines impliquées dans le métabolisme énergétique mitochondrial dans le cœur de ratons de 21 jours
Chez les animaux carencés il existait une augmentation de l’abondance de certaines protéines comme par exemple : la fatty acid binding protein-3 (FABP-3), l’acyl-coenzyme A thioestérase 2 (ACOT-2), l’isocitratedéhydrogénase (IDH3A) et la protéine Hspd1 (HSPD1), (37, 65, 26 et 19 %, respectivement) (Figure 32).
Figure 32. Analyse protéomique de quelques protéines impliquées dans le métabolisme énergetique mitochondrial dans le cœur de ratons de 21 jours.
2. Etude de l’expression de protéines impliquées dans le métabolisme énergetique par Western Blot dans les cœurs des ratons
Nous avons confirmé les résultats d'analyse protéomique par Western Blot (Figure 33).
Figure 33. Etude de l’expression de protéines impliquées dans le métabolisme énergetique par Western Blot dans les cœurs des ratons. Les bandes ont été mesurés par densitomètre et les
niveaux d’expression ont été normalisée aux niveaux de la protéine Tubuline dans le même échantillon et ont été exprimées en unités arbitraires. Différences significatives *p<0,05 ; ***p=0,001, ANOVA, n=8.
3. Ingenuity Pathway Analysis
La modélisation des résultats obtenus en protéomique par le logiciel « Ingenuity Pathway
Analysis» a montré que les plus grands changements d’expression des protéines chez les
ratons carencés en groupements méthyles étaient en relation avec des protéines du métabolisme énergétique. En effet, PGC-1α,était en relation avec le peroxisome
proliferator-activated receptoralpha (PPARα), l’estrogen Related receptor-α (ERRα) et avec peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), et la diminution de l'expression de SCAD
était en relation avec PPARα et PGC-1α. Par ailleurs, NDUFA10, NDUFV2 et IDH3A avaient un lien avec PGC-1α. FABP-3 et TFE-α étaient en relation avec ERRα, PPARα et PGC-1α ; l’ACOT2 avec PPARα: et enfin, HSPD1 avec PPARγ et PGC-1α (Figure 34).
Figure 34. L’Ingenuity pathways analysis (IPA) montre que les changements d’expression des protéines en protéomique sont en lien avec l’oxydation d’acides gras et le métabolisme énergetique dans le myocarde. Les symboles décrivent la fonction de la protéine et le type d’interaction : Interaction direct
Interaction indirect .
Publication lieé à cette IPA sont (1) ESRRA/FABP3. Effet de l'expression: Huss JM et al Mol Cell Biol 2004;24:9079–91 [163]; (2) ESRRA/HADHA. Effet de l'expression: Huss JM et al Mol Cell Biol 2004;24:9079–91 [163]; (3) HADHA/PPARA. Protéine–DNA interactions: Liu
YY et al Endocrinology 2007;148:1206–17; [231](4) PPARγ/FABP3. Protéine–DNA
interactions: Schachtrup C et al Biochem J 2004;382:239–45 [232]; (5) PPARγ/FABP1. Activation: Nielsen R et al Mol Cell Biol 2006;26:5698–714. Expression: Barz T et al Cancer
Res 2006;66:11975–82 and Drori S et al Genes Dev 2005;19:362–75. Protéine–DNA interactions: Schachtrup C et al Biochem J 2004;382:239–45. Protéine–protéine interactions: Wolfrum C et al Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:2323–8; [232-236] (6) FABP1/PPARA. Activation: Nielsen R et al Mol Cell Biol 2006;26:5698–714. Expression: Lindén D et al J Biol Chem 2002;277:23044–53. Protéine–DNA interactions: Schachtrup C et al Biochem J 2004;382:239–45. Protéine–protéine interactions. Hostetler HA et al J Lipid Res 2009;50:1663–75 et Wolfrum C et al Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:2323–8.[232, 233, 237] [238] (7) PPARA/ACADS. Effet de l'expression: Aoyama T et al J Biol Chem. 1998 273(10):5678–84 and Yu S et al J Biol Chem 2001 Nov 9;276(45):42485–91 et Kersten S et al FASEB J 2001;15:1971–8.[239-241] (8): PPARα/PPARγC1α. Activation: Barger PM et al J Biol Chem 2000 ; 276:44495–501 et Miura S et al Endocrinology 2008;149:4527–33. Expression: Miura S et al J Biol Chem 2003;278:31385–90; Protéine–protéine interactions: Vega RB et al Mol Cell Biol 2000;20:1868–76, et Lin J et al J Biol Chem 2005;278:30843–8
et McGill JK et al Cell 2006;127:465–8.[242-246] (9) PPARγC1α/NDFUV2. Effet de
l'expression: Sandri M et al Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:16260–5; [247] (10) PPARγC1α/IDH3α. Effet de l'expression: Burgess SC et al J Biol Chem 2006;281:19000– 8;[248] (11) NDFUV2/NDUFA10. Interaction de NADH déhydrogenase. (12) LEP/FABP3. Indirect Effet de l'expression: Hidaka S et al FASEB J. 2002 Apr;16(6):509–18; (13) LEP/PPARγC1α. Effet de l'expression: Yoon JC et al Nature 2001;413:131–8;[249] (14)
LEP/PPARα. Effet de l'expression: Liang CP et al J Biol Chem 2001;276:49066–76, Gallardo
N et al Endocrinology 2007;148:5604–10;[250, 251] (15) AKR1B1/PPARα (Synonyme Ahr-1,
Akr1b1, Akr1b3, Aldolase Reductase, Aldor1, Aldr1, ALR2, AR). Activation/phosphorylation: Qiu L et al J Biol Chem 2008; 283:17175–83;[252] (16) HSPD1 (HSP60)/ PPARγ. Effet de l'expression: Artwohl M et al Thromb Haemost. 2005; 93:810–5. [253] (17) MTE1 (ACOT2)/PPARA. Effet de l'expression: Stavinoha MA et al Am J Physiol Endocrinol Metab 2004;287:E888–95;[254] (18) FABP3 (H-FABP)/PPARA. Protéine–DNA interactions: Schachtrup C et al Biochem J 2004; 382:239–45. Effet de l'expression: Kawabe K et al Int J Biochem Cell Biol. 2005;37:1534–46 [232, 255].
4. Analyse de Western Blot des récepteurs nucléaires
Nous avons ensuite évalué l’expression de PGC-1α, PPARα, ERRα et PPARγ, parce qu'ils jouent un rôle clé dans la régulation du métabolisme mitochondrial. Les résultats montrent qu’il existe une diminution de l'expression de PPARα et ERRα et une augmentation d'expression de PPARγ, mais absence de changement d'expression de PGC-1α, dans le groupe carencé (Figure 35).
Figure 35. Etude de l’expression de protéines impliquées dans le métabolisme énergétique par Western Blot dans les cœurs des ratons. Les bandes ont été mesurées par densitométrie et les
niveaux d’expression ont été normalisés aux niveaux de la protéine Tubuline dans le même échantillon et ont été exprimés en unités arbitraires Différence significative *p<0,05 ; **p=0,01***p=0,001, ANOVAn=8
5. Effets post traductionnels de PGC-1α
Puisque PGC-1α est un régulateur majeur du métabolisme mitochondrial, les possibles modifications étaient ntéressantes pour nous. En effet, son activité est contrôlée par des modifications post traductionnelles qui peuvent être influencées par la carence en groupements méthyles. Nous avons confirmé par analyse d'immunoprécipitation que la carence en donneurs de méthyles provoque une diminution de la méthylation et une diminution de l'acétylation de PGC-1α. Ce résultat peut être la conséquence de la diminution du ratio SAM/SAH (Figure 36). Nous avons ensuite évalué l’expression de PRMT1 qui est une méthyltransférase et qui peut méthyler et activer PGC-1α, et comme prévu, l’expression était diminuée chez les ratons carencés. Finalement, nous avons observé une diminution de l’expression de SIRT1, une désacétylase qu’active PGC-1α, cette diminution de l’expression par Western Blot de SIRT1 a été confirmée par une diminution de son activité enzymatique.
Figure 36. Etude de l’expression de protéines impliquées dans la modification de PGC-1α par Immunoprecipitation et Western Blot dans les cœurs des ratons. Les bandes ont été
mesurées par densitométrie et les niveaux d’expression ont été normalisés aux niveaux de la protéine Tubuline dans le même échantillon et ont été exprimés en unités arbitraires *p<0,05 ; **p=0,01***p=0,001, ANOVA n=8
En résumé,