ll.l Etude par dénombrement sur un biofilm préformé 11.1.1 Formation in vitro du biofilm

La formation des biofilms est réalisée selon la technique décrite par Tré-Hardy et al.

(2008). Les puits d’une microplaque Nunc Micro Wells Plates® (Nunc MicroWell Plates;

Nalge Nunc International Corp. Rochester, NY) sont ensemencés par 100 pL de la SBI

100 fiL de la suspension bactérienne à 10’ ufc/mL Incubation à 37 °C pendant 24 h (biofllm jeune) et 12 jours (biofllm mature) --->

Matériel et Méthodes

préparée dans un milieu CAMHB. Un témoin négatif, contenant uniquement du milieu de

culture CAMHB sans ajout de germes, est réalisé de manière à valider la stérilité du milieu.

La microplaque est ensuite recouverte d’un couvercle contenant 96 pointes (Nunc TSF,

Transférable Solid Phase Screening System; Nalge Nunc International) sur lesquelles le

biofilm peut se former. La microplaque eontenant l’inoculum et munie de son couvercle est

incubée sous agitation orbitale à 37 °C pendant 24 h à 30 tpm (Unitron; Infors AG,

Bottmingen, Switzerland). Le biofilm formé (biofilm jeune de 24 h) est ensuite exposé aux

agents antibactériens.

La formation de biofilm de 12 jours est étudiée selon un principe identique. Après 24 h

d’incubation, une nouvelle microplaque contenant uniquement 100 pL de milieu CAMHB

dans chaque puits est préparée afin de servir de nouveau milieu pour la formation du biofilm.

Le couvercle de la plaque précédente, sur lequel le biofilm s’est développé, est alors transféré

sur cette nouvelle plaque et incubé sous agitation orbitale à 37 °C pendant 24 h. L’opération

de mise en contact des pointes avec un nouveau milieu est répétée quotidiennement sur une

durée de 12 jours. Après 12 jours de formation, le biofilm qui est « mûr » est exposé aux

agents antibactériens.

11.11.1.2 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L,

sur un biofilm jeune et mature

Après formation d’un biofilm jeune de 24 h, le couvercle de la plaque multipuits est

retiré et les pointes sont immergées dans une nouvelle microplaque contenant différentes

concentrations de CSA-13 seul ou en association avec de la tobramycine à 4 mg/L. Après 24 h

d’incubation à 37 °C, l’activité des agents antibactériens est déterminée.

Après formation d’un biofilm mature de 12 jours, le couvercle de la plaque multipuits

est retiré et les pointes sont immergées 2 fois par jour dans une nouvelle microplaque

contenant différentes concentrations de CSA-13 seul ou en association avec de la tobramycine

à 4 mg/L. L’effet des agents antibactériens est évalué après 1 (administration unique), 2 et 9

jours. L’effet antibactérien est étudié sur 8 souches pour les biofilms jeunes (ATCC PAOl, ATCC 9027, ATCC 15442, PYOl, PY02, MC75-450457, MC093-450507, MC099-450467),

et sur 6 souches pour les biofilms matures (ATCC PAOl, PYOl, PY02, MC75-450457,

MC093-450507, MC099-450467).

L’activité des agents antibactériens est évaluée par un dénombrement des germes (Tré-

Hardy et al., 2008). Les pointes sont rincées à l’aide d’un tampon phosphate de potassium 10

mM (pH 7,5) isotonique afin d’éliminer les cellules non fixées au biofilm. Après rinçage, le

biofilm est mis en contact avec un nouveau milieu CAMHB. La microplaque est placée dans

un bain à ultrasons à 25 °C pendant 5 min dans le but de décrocher les bactéries présentes au

niveau du biofilm. Un dénombrement des bactéries persistantes, avant et après traitement, est

réalisé. Des aliquots sont prélevés, dilués, et répartis dans des boîtes de Pétri. Une gélose TSA

fraîchement préparée est coulée dans les boîtes et, après solidification, celles-ci sont incubées

à 32-34 °C pendant 48 h. La diminution logarithmique en ufc des biofilms traités est calculée

par la formule suivante : diminution logarithmique = log(ufCcontrôie positif)“log(ufC;c), où x

correspond à la concentration testée de l’agent antimicrobien seul ou en combinaison.

Les courbes dose-réponse du CSA-13 sont ajustées à l’équation : variation des log(ufc)

= variation maximale des log(ufc) * [CSA-13]/ (Ko + [CSA-13]) par ajustement de deux

paramètres (variation maximale des ufc/mL et Ko) avec une contrainte (diminution maximale

inférieure à 7). La qualité de l’ajustement est évaluée par mesure du coefficient de

détermination (r^) qui est une estimation de la qualité de l’ajustement.

11.11.2 Etude par MCBL sur un biofilm préformé

IL 11.2.1 Expression de la GF P

Pour visualiser les souches cliniques de P. aeruginosa à l’aide de la MCBL, un

plasmide (pMF230) exprimant de manière constitutive la GFP est introduit dans chaque

souche de P. aeruginosa par croisement triparental. Le plasmide pMF230 contient le gène

GFPmutl (Cormack et al., 1996) et un marqueur de résistance à la carbénicilline.

L’appariement triparental est une forme de conjugaison bactérienne où un plasmide conjugatif

présent dans une souche bactérienne aide à transférer un plasmide mobilisable présent dans

Matériel et Méthodes

Dans notre cas, la conjugaison triparentale fait intervenir les 3 souches bactériennes suivantes:

- une souche receveuse de P. aemginosa (souche clinique) dans laquelle on souhaite

introduire le plasmide mobilisable (pMF230),

- une souche donneuse de E. coli portant le plasmide mobilisable pMF230 et qui peut

utiliser les fonctions de transfert du plasmide conjugatif (Nivens et al., 2001),

- une souche mobilisatrice de E. coli (helper strain) portant le plasmide conjugatif

pRK2013 codant pour les gènes requis dans la conjugaison et le transfert de F ADN

(Figurski et Helinski, 1979).

Les cultures bactériennes de E. coli pMF230 et E. coli pRK2013 sont obtenues après

une nuit d’incubation à 37 °C sous agitation dans un milieu LB contenant 300 mg/L de

kanamycine. Deux cent cinquante pL d’une culture bactérienne de la souche clinique de P.

aemginosa incubée une nuit sont ajoutés dans 25 mL de Tryptic Soy Broth (TSB) et cultivés

pendant 5 h à 42 °C et 150 tpm. Après incubation, une strie de cette suspension bactérienne

est ensemencée sur une boîte de gélose LB. La souche clinique est mise en contact avec une

strie d’une culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pMF230 et une strie d’une

culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pRK2013. Les 3 stries se croisent en un

même point sur la gélose. Après une nuit d’incubation de la gélose à 37 °C, quelques colonies

au niveau du croisement des 3 stries sont prélevées et incubées sur une gélose Pseudomonas

agar contenant 150 mg/L de carbénicilline afin de sélectionner les clones de P. aemginosa

contenant le plasmide pMF230.