IL1.2 Formation des biofilms par coloration au cristal violet (CV)
II.I. 3 Formation des biofilms par dénombrement
II.9 ETUDE SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES
II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB
La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est effectuée dans des
microplaques par la technique de microdilution de 2 en 2 en bouillon Mueller Hinton Broth
ajusté en ions Ca^^ et Mg^"^ (CAMHB), conformément au protocole du CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute, 2003). Les puits contiennent 100 [tL de chaque concentration
de produit à tester par dilution de 2 en 2 à partir du puits initial. Les puits de la microplaque
sont inoculés par 100 pL de la SBI. Deux puits contenant le bouillon de culture sont inclus
dans le test. L’un des puits est inoculé avec le microorganisme testé (témoin positif) et l’autre
contient uniquement 200 pL de CAMHB et sert de témoin négatif afin de valider la stérilité
du milieu. Les résultats sont lus, après une incubation de la microplaque à l’étuve à 35 °C
pendant 24 h, par observation visuelle de l’absence de turbidité en comparaison avec le
contrôle négatif. Afin de déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB), les puits
clairs de cette même microplaque sont repiqués à l’aide d’anses stériles de 10 pL, ensuite
étalés sur milieu MH solide et incubés 24 h à 35 °C avant la lecture des résultats.
II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine
(NPN)
Principe
La molécule de NPN émet une fluorescence importante lorsqu’elle passe d’un
environnement polaire, par exemple le milieu de culture, vers un compartiment hydrophobe,
par exemple la membrane externe de la bactérie. La mesure d’une augmentation de la
fluorescence reflète ainsi la perturbation de la membrane liée à l’insertion du composé dans la
membrane.
Protocole expérimental
L’étude de la perméabilisation membranaire de P. aeruginosa au NPN est basée sur
une technique décrite précédemment (Loh et al., 1984) et est étudiée sur les souches ATCC
PAOl, MC093-450507 et PYOl. Les SBI sont centrifugées à 3000 tpm pendant 10 min et les
cellules sont suspendues dans un tampon HEPES 5 mM (pH 7,35) contenant 10 mM d’azide
de sodium afin d’atteindre une DO 600 nm de 0,5. Cette nouvelle suspension cellulaire est
laissée au repos pendant 30 à 60 min à température ambiante avant l’ajout des réactifs. Une
solution stock de NPN est préparée par solubilisation du réactif dans de l’acétone. Une
microplaque à fond noir (96F Nunclon Delta Black Microwell SI) est inoculée avec la
suspension de cellules et le NPN est ajouté à une concentration finale de 10 pM. Différentes
concentrations de CSA-13 sont ajoutées aux puits et l’augmentation de l’intensité de la
fluorescence émise par le NPN est suivie pendant 10 min à 30 °C. Les échantillons sont
soumis à une lumière d’excitation dont la longueur d’onde est de 310 nm et la lumière émise
est lue à une longueur d’onde de 460 nm à des intervalles de temps de 15 sec. A la fin de la
mesure, une solution de Triton X-100 à 1 % (VA^) est ajoutée afin d’estimer l’insertion
maximale du NPN dans la membrane bactérienne et les résultats sont calculés en prenant cette
valeur comme référence. Les résultats sont exprimés comme variation de la fluorescence ±
SEM après 10 min d’exposition au CSA-13. Les résultats sont ajustés à l’aide de l’équation
d’une hyperbole à une composante.
IL9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa
L’interaction membranaire du CSA-13 avec les différentes souches de P. aeruginosa
est étudiée à l’aide du CSA-119, un analogue fluorescent du CSA-13 ou le dérivé dansyl-
CSA-13. Les spectres d’émission et d’excitation du CSA-119 dans un tampon phosphate salin
(PBS) sont enregistrés à l’aide d’un fluorimètre (Photon Technology International,
Birmingham, NJ, Etats-Unis). Un spectre d’émission de la molécule en présence et en absence
de la souche de référence ATCC PAOl est également réalisé afin de mettre en évidence la
spécificité de l’interaction. L’étude de la sensibilité des 8 souches au CSA-119 est effectuée
par mesure de l’augmentation de la fluorescence liée à l’interaction du CSA-119 avec la
membrane bactérienne. Deux cents pL de la SBI dans un tampon PBS sont transférés dans les
puits d’une plaque 96-puits. La lumière émise à 495 nm après excitation des puits à 345 nm
est mesurée toutes les 40 sec à l’aide de notre lecteur de microplaques. Trois min après le
début de l’essai, 1 à 5 pL de CSA-119 (concentrations finales 1 ; 2 ; 5 et 6 mg/L) sont ajoutés
aux puits et la fluorescence est lue pendant 15 min. La microplaque est agitée avant chaque
Matériel et Méthodes
contrôles (puits contenant uniquement la sonde fluorescente et du tampon PBS sans
bactéries).
11.9.4 Essai de viabilité par dénombrement
Cent fxL de la SBl de la souche ATCC PAOl sont déposés dans les puits d’une
microplaque. A chaque puits, 100 pL du produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide
pluronique 5% ou LL-37) sont ajoutés afin d’atteindre un volume final de 200 pL/puits. Un
contrôle négatif, contenant uniquement du milieu de culture, ainsi qu’un contrôle positif,
contenant la suspension bactérienne sans le produit à tester, sont inclus dans l’essai. La plaque
est incubée à 37 °C pendant 3 et 24 h (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 5 %) ou
1 h (LL-37). Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : 10 pL de chaque puits sont
prélevés et dilués. Chaque dilution est étalée sur gélose TSA et incubée pendant 48 h à 32-34
°C. Les colonies sont comptées et les résultats exprimés en ufc/mL.
11.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à Viodure de propidium (IP)
Principe
L’IP est un agent fluorescent imperméable aux membranes et donc exclu des cellules
vivantes. Le fluorophore est utilisé pour détecter les cellules mortes. Il s’intercale dans les
deux brins de l’ADN et de l’ARN des cellules mortes. Lorsqu’il est lié aux acides nucléiques
sa fluorescence augmente de 20 à 30 fois.
Protocole expérimental
Différentes concentrations des produits à tester (CSA-13, association CSA-13/acide
pluronique ou peptides) sont ajoutées aux puits d’une microplaque à fond noir. On ajoute dans
chaque puits 100 pL de la SBI contenant l’IP (concentration finale 10 pM) afin d’atteindre un
volume final de 200 pL par puits (milieu de culture pour l’étude du CSA-13 et de l’acide
pluronique F-127 : tampon de phosphate de potassium 1 mM pH 7 ; milieu de culture pour
l’étude des peptides ; BBM complémenté de 0,5 % de casaminoacides). L’intensité de la
fluorescence est lue pendant 1 h à l’aide d’un lecteur à microplaque à des longueurs d’onde
d’excitation et d’émission de 540 nm et 590 nm.
lacHbatloH à 37 peadant 24 et 48 h • Lavage 3 fois avec H2O • Séchage 200 fiL cristal siolet 0,1 */• 540 Bm
Matériel et Méthodes
11.10 ETUDE SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM
La formation du biofilm est réalisée selon la méthode décrite par Stepanovic et al.
(2000) par la technique de coloration au CV.
CSA-13 : Les puits d’une microplaque sont inoculés par 200 pL de la SBl (milieu
BHI), en présence ou en absence de 20 pL de CSA-13 à une concentration finale de 1 mg/L,
et incubés à 37 °C dans une atmosphère humide pendant 24 et 48 h.
Peptides : Les puits d’une microplaque sont inoculés par 90 pL de la SBI (milieu BM2
contenant 0,5 % de casaminoacides). Dix pL des peptides, à différentes concentrations, sont
ajoutés aux bactéries. La microplaque est incubée à 37 °C dans une atmosphère humide
pendant 18 h.
Un contrôle positif (suspension bactérienne sans le produit à tester) et négatif
(uniquement le milieu de culture) sont inclus dans l’expérience. L’évaluation de la formation
de biofilm est réalisée par mesure colorimétrique de l’incorporation du CV par les cellules
ayant adhéré aux puits et de la coloration des autres composants de la matrice. Le milieu des
puits est aspiré et les puits sont lavés 3 fois à l’aide de 200 pL d’eau distillée. Après séchage
des puits pendant 45 min à l’air libre, 200 pL d’une solution à 0,1 % (nW) de CV sont
ajoutés. Le colorant est laissé pendant 45 min en contact avec les puits avant d’être aspiré. Les
puits sont rincés 3 fois à l’aide de 300 pL d’eau distillée, ensuite le colorant est dissous à
l’aide d’une solution d’acide acétique à 33 %. L’absorbance de chaque puits est lue à 540 nm
à l’aide de notre lecteur de microplaques. Les résultats sont exprimés en ADO 540 nm (DO 540 nm
échantillon - DO 540 nm contrôle).