Souches mucoïdes
IL 1.2 Formation des biofilms par coloration au CV
II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS
Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR,
sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé les 4 gènes après amplification par
PCR. Pour toutes les souches, le fragment amplifié correspond à l’amplicon attendu pour rhll
(606 pb) et pour rhlR (727 pb). Pour les 2 autres gènes, lasl et lasR, les amplicons ont les
tailles attendues pour 7 souches. La souche ATCC PAOl est la seule exception: lasl a la taille
correcte mais 2 fragments sont amplifiés pour lasR. Un de ces fragments a la taille attendue
(726 pb) et le deuxième est plus petit, d’environ 600 pb.
Après leur extraction et leur purification, les fragments amplifiés sont séquencés. Pour
chaque souche une recherche blast est effectuée en utilisant une combinaison des séquences
des 4 gènes. Le meilleur score pour la souche ATCC PAOl est obtenu avec les souches de
référence suivantes: ATCC PAOl (4384) > LESB58 (4323) > M18 (4312). Cet ordre est
différent pour les autres souches (LESB58 > M18 > ATCC PAOl) sauf pour la souche PYOl
(LESB58 > ATCC PAOl > M18). Il faut remarquer que les scores obtenus en comparant les 8
souches étudiées avec les souches LESB58, ATCC PAOl et Ml8 ne sont jamais très
différents (moins de 2 %). Les séquences des 4 gènes de toutes les souches (excepté la souche
ATCC PAOl) sont donc comparées au génome de la souche LESB58. Les séquences des
protéines sont comparées à l’aide du logiciel SIM, un logiciel permettant l’alignement de
séquences de protéines (Expasy, Switzerland).
Comme présenté dans le tableau 4, seules des mutations silencieuses sont détectées
dans les gènes lasl, rhll et rhlR. Les souches MC099-450467 et PYOl présentent les
mutations de lasR les plus significatives. Dans la souche MC099-450467, la mutation G584A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Après extraction de l’ADN des 8 souches, les gènes lasi et lasR (figure A) et les gènes rhll et
rhlR (figure B) sont amplifiés. Colonnes 1 et 2 : ATCC PAOl ; colonnes 3 et 4 : MC099-
450467 ; colonnes 5 et 6 : MC093-450507 ; colonnes 7 et 8 ; MC75-450457 ; colonnes 9 et 10 : PYOl ; colonnes 11 et 12 : PY02 ; colonnes 13 et 14 : ATCC 9027 ; colonnes 15 et 16 : ATCC 15442. La taille des amplicons est estimée par comparaison avec le GeneRuler 100-bp plus DNA ladder de part et d’autre du gel. Les gels sont représentatifs de 3 expériences indépendantes (n = 3).
Caractérisation phénotypique des souches
introduit un codon STOP prématuré en position 195 ce qui tronque le domaine C-terminal de
la protéine (résidus 195 à 237). Dans la souche PYOl, la délétion de 2 pb provoque une
modification du cadre de lecture ce qui induit des changements majeurs dans la structure
primaire de la protéine (modification de la séquenee de la protéine après l’acide aminé R122). Trois souches ont une mutation ponctuelle modifiant le résidu 208 pour la souche MC093-
450507 (V208M) et modifiant le résidu 212 pour les souches ATCC 9027 et ATCC 15442
(M212T pour ATCC 9027 et M212V pour ATCC 15442).
Deux séquences sont obtenues pour la souche ATCC PAOl. Une de ces séquences est
identique à la séquence du gène lasR de cette souche. La deuxième séquence a une délétion
majeure entre les résidus 49 à 145 ce qui explique la taille plus petite du deuxième amplicon
observé sur le gel effectué après la PCR (628 bp au lieu de 726 bp).
Tableau 4 : Mutations des gènes lasi, lasR, rhll et rhlR
LasI LasR Rhll RhlR
Souches Gène Protéine Gène Protéine Gène Protéine Gène Protéine
MC099-450467 T.S. T.S. G584A W195 Stop T.S. T.S. T147C T364C C396T T.S. MC093-450507 G264C G279A T.S. G622A V208M T.S. T.S. T364C C453A T.S. MC75-450457 G279A G264C T.S. T.S. T.S. T.S. T.S. T364C C453A T.S. PYOl T150C C441G C531T T.S. G108C C366del C367del Décalage du cadre de lecture T.S. T.S. T147C T364C C591T T.S. PY02 T.S. T.S. T.S. T.S. T.S. T.S. C258T C453A G567C T.S. ATCC 9027 T.S. T.S. T635C M212T T207C T.S. T147C T364C C591T T.S. ATCC 15442 T.S. T.S. A634G M212V T207C T.S. T147C T364C C591T T.S.
Les séquences des 4 gènes dans 7 souehes de P. aeruginosa sont comparées avec les
séquences de ces gènes chez P. aeruginosa LESB58. T.S. = Type sauvage
C,2-HSLetBFRT® formation du biofilm Ci2~HSL et protéases C12-HSL et rhamnolipides C12-HSL et sensibilité à la tobramycine Production de C12-HSL Ci-HSLetBFRT® C4-HSL et protéases C4-HSL et rhamnolipides C4-HSL et sensibilité à la tobramycine Production de C 4-HSL
La production de Cn>6-HSL (figures de gauche) et de C4-HSL (figures de droite) est comparée à la production de rhamnolipides, l’adhésion, la formation du biofilm, la production de protéases et la sensibilité à la tobramycine. La corrélation est mentionnée sur chaque graphique.
Caractérisation phénotypique des souches
11.8 CORRELATIONS ENTRE LA PRODUCTION D’AHL ET DES
CARACTERISTIQUES PHENOTYPIQUES
La production de C4-HSL est significativement corrélée à la production de rhamnolipides (n = 8 ; P = 0,017) ou à la formation du biofilm (n = 8 ; P = 0,017) par les différentes souches (figure 57). Le coefficient de corrélation (coefficient de Pearson) est
proche de 1 pour ces deux corrélations (r = 0,787). Il n’y a pas d’autre corrélation
significative entre une caractéristique phénotypique des souches et leur production d’AHL.
Pour la clarté des résultats, un tableau récapitulatif de l’ensemble des propriétés des
souches est repris en annexe (annexe 1).
III. DISCUSSION
Adhésion et formation du bioHIm
Nous avons étudié la cinétique d’adhésion et de formation du biofilm par 8 souches de
P. aeruginosa à l’aide de deux méthodes, la technique du BFRT® et la technique de coloration
par le CV.
Nos résultats indiquent que la technique du CV détecte le développement du biofilm
des 8 souches mais à des temps différents. Quatre souches développent un biofilm après 6 h.
Les 4 autres souches développent un biofilm après 24 h. Après cette phase initiale,
l’absorbance du CV augmente avec le temps et après 48 h toutes les souches montrent une
forte coloration par le CV. Ces observations sont cohérentes avec la vision actuelle que les
bactéries en général, et P. aeruginosa en particulier, résident de manière prédominante sous la
forme d’un biofilm (Costerton, 2001).
Nous n’avons pas observé de relation entre l’importance du biofilm après 48 h et la
capacité des souches à former un biofilm après 6 h : la souche PY02 qui a une absorbance
faible après 6 h forme un des biofilms les plus importants après 48 h. A l’opposé, les souches
ATCC 9027 et ATCC 15442 adhèrent fortement à la surface du puits après 6 h mais ne
forment pas de biofilm important après 48 h. Ces résultats confirment également que le
développement d’un biofilm procède par différentes étapes distinctes (O’Toole et al., 2000).
Après 6 h nous n’avons pas observé de relation entre le caractère mucoïde ou non
mucoïde des souches et leur capacité à initier rapidement le développement d’un biofilm :
seule une des 4 souches mucoïdes (MC093-450507) est fortement colorée par le CV après 6
h. Ces résultats sont en accord avec Hay et ses collaborateurs qui ont montré que durant la
phase initiale d’attachement, la souche non mucoïde PAOl a une adhésion plus importante
que toutes les souches mucoïdes testées (Hay et al., 2009). Après ce stade initial, la vitesse de
formation du biofilm est significativement plus importante pour les souches mucoïdes que
pour les souches non mucoïdes. Ce résultat confirme l’augmentation de la production
d’exopolysaccharides par P. aeruginosa durant la formation du biofilm (Hoyle et al., 1993).
La cinétique d’adhésion des bactéries au fond du puits, étudiée par la technique du
Caractérisation phénotypique des souches
souches immobilisent complètement les billes en moins de 90 min. Les 4 autres souches
n’adhèrent pas aux puits après 90 min. La souche ATCC PAOl est la souche qui s’est
attachée le plus rapidement au fond du puits et qui peut immobiliser les billes de manière
significative après 45 min seulement. Le dénombrement des bactéries adhérentes de la souche
ATCC PAOl a révélé que 3 fois plus de bactéries sont attachées au fond du puits après 30
min en comparaison avec le nombre de bactéries attachées après 10 min.
Macé et al. (2008) et Tré-Hardy et al. (2009) ont également suggéré que les cinétiques
de formation du biofilm par P. aeruginosa varient parmi les souches mais que toutes les
souches sont capables de former un biofilm après une incubation plus longue.
Dans ce travail, nous avons comparé la capacité de 8 souches de P. aeruginosa à
adhérer à une surface et à former un biofilm par deux techniques basées sur la culture des
bactéries en microplaque. La technique du CV est une méthode assez laborieuse et la
procédure longue et non standardisée (nombre d’étapes de lavages, conditions de lavage,
durée de coloration, concentration en CV, ...). Par ailleurs cette technique ne mesure pas la
viabilité cellulaire dans le biofilm mais la quantité de biomasse car aussi bien les cellules
(vivantes ou non) que la matrice sont colorées par le CV (Pitts et al., 2003). Cette technique a
été décrite pour la première fois par Christensen et al. (1985), améliorée par Stepanovic et al.
(2000) et est actuellement la plus utilisée pour quantifier l’adhésion bactérienne et la
formation de la biomasse. D’après nos résultats, la méthode du BFRT® semble aussi efficace
que le dénombrement classique des bactéries pour étudier l’adhésion des bactéries et la
formation rapide du biofilm. Les deux populations de souches (formant rapidement et
lentement un biofilm) déterminées avec le BFRT® sont similaires au groupe caractérisé par la
technique de coloration au CV après 6 h. La cohérence dans les résultats obtenus avec les
deux méthodes confirme que toutes les deux mesurent la phase initiale réversible de
l’adhésion. Une bonne corrélation entre le BFRT® et le CV a également été avancée par
Crémet et ses collaborateurs dans l’étude de la production du biofilm par différentes souches
cliniques de E. coli (Crémet et al., 2013). La technique du BFRT® donne des résultats
significatifs plus rapidement que la méthode basée sur la coloration des bactéries et de la
matrice organique par le CV qui n’a pas montré de biofilm avant 4 h. Récemment, Liesse
lyamba (2012) indique que la méthode du BFRT® est plus efficace et plus indiquée pour une
évaluation rapide de l’adhésion bactérienne par différentes souches de S. aureus en
comparaison avec la technique de coloration au CV qui nécessite des temps d’incubation plus
longs pour observer une augmentation significative de l’absorbance. La technique du BFRT
nous semble dès lors plus sensible que la technique de coloration au CV pour la détection de
l’adhésion des bactéries et des stades initiaux de la formation du biofilm. La différence de
sensibilité des deux méthodes et la meilleure sensibilité du BFRT® peut être expliquée par
l’absence des étapes de lavage dans cette procédure et par le fait que cette méthode requiert
peu de manipulation. Le BFRT® semble donc être une méthode simple et rapide spécialement
adaptée à la détermination de la capacité de P. aeruginosa à initier la formation du biofilm.
Elle a été utilisée avec succès dans l’étude de la formation des biofilms par des bactéries
(Chavant et al., 2007), des microalgues (Badel et al., 2011) et même pour étudier des
polysaccharides (Badel et al., 2008).
Cependant, pour étudier des biofilms plus importants et à des stades plus avancés, la
technique de coloration au CV est préférée. Malgré les avantages du BFRT®, cette méthode
est rapidement saturée et ne peut donner une estimation précise de biofilms importants. Cette
conclusion rejoint celle de Liesse lyamba et al. (2011).
En outre, nous rencontrons certains inconvénients lors de l’utilisation de la technique
du BFRT®. L’étude de l’effet d’un composé antimicrobien sur la formation du biofilm par le
BFRT® nécessite un contrôle préalable de l’effet de cet agent sur les billes magnétiques. En
absence d’effet sur la mobilité des billes, le BFRT® permet l’étude de l’aetivité de divers
composés sur la formation du biofilm. Nous avons cependant mis en évidence une interaction
entre les billes magnétiques chargées positivement et négativement et le CSA-13 ou les PAM
dérivés du LL-37 rendant l’incorporation de ces eomposés dans l’étude sur la formation du
biofilm impossible (données non montrées). Ces interactions entre les billes et les peptides ont
été observées même à de très faibles concentrations en LL-37 (inférieures à 1 pM). Les forces
électrostatiques entre les billes chargées et le composé (CSA-13 ou peptide LL-37) ne seraient
pas responsables de cette interaction étant donné que des interférences similaires ont été
notées avec les billes portant des charges opposées. Ces interactions inattendues entre un
composant du milieu de culture et les billes ont été observées précédemment (Liesse lyamba
et al., 2011). Les auteurs démontrent que l’ajout de la protéinase K dans le milieu du BFRT®
provoque une diminution importante de l’IFB suggérant que la suspension d’enzyme
immobilise les billes ou interfère avec leur sensibilité à l’aimant. Badel et son équipe
constatent que certains milieux de culture peuvent interférer avec la mobilité des billes et que
Caractérisation phénotypique des souches
interférences (Badel et al., 2011). Badel et al. (2008) démontrent aussi que la pronase bloque
la migration des billes et rend les analyses par le BFRT® difficiles.
Mobilité bactérienne et rhamnolipides
Le swarming est une mobilité de surface affectée non seulement par le flagelle mais
également par les pili de type IV et les rhamnolipides (Kbhler et al., 2000). La mobilité de
type swarming et la production de rhamnolipides ne peuvent distinguer la population de
bactéries s’attachant rapidement à la surface du fond du puits des populations adhérant
lentement. La souche ATCC PAOl a la plus grande mobilité de type swarming. Les autres
souches présentent une mobilité swarming beaucoup moins importante et leur mobilité n’est
pas liée à leur capacité à s’attacher rapidement à une surface ou à former un biofilm. Les
rhamnolipides sont des molécules amphipatiques composées d’un lipide hydrophobe et d’un
sucre hydrophile. Ils sont les constituants principaux des biosurfactants produits par P.
aeruginosa (Soberon-Chavez et al., 2005). Ils favorisent le swarming car ils agissent comme
agents mouillants qui réduisent la tension de surface (Caiazza et al., 2005). Trois souches
(ATCC 9027, ATCC 15442 et MC099-450467) ne produisent pas de rhamnolipides et pour la
souche PYOl la production de rhamnolipides n’est pas significative. Parmi les 4 autres
souches, la souche MC093-450507 est la productrice de rhamnolipides la plus importante.
Cette séquence n’est pas corrélée avec la capacité des différentes souches à initier le
développement du biofilm. Le swimming est une autre forme de mobilité qui est dépendante
du flagelle (Murray et Kazmierczak, 2006). Excepté pour la souche ATCC PAOl qui a une
activité très importante, la différence au sein des autres souches est plus faible. Les 4 souches
avec la mobilité de type swimming la plus importante sont les 4 souches avec un BFRT®
positif ou qui forment rapidement un biofilm avec la méthode de CV. Ceci est cohérent avec
la vision actuelle selon laquelle le flagelle est impliqué dans les étapes initiales du
développement du biofilm (O’Toole et Kolter, 1998b). Nos résultats confirment donc
l’importance du flagelle dans la phase d’attachement initial pour la formation du biofilm.
Sensibilité à la tobramycine
Les jeunes biofilms (24 h) formés par les souches non mucoïdes sont significativement
plus affectés par la tobramycine que les biofilms mucoïdes. Après 24 h, la formation des
biofilms par les souches mucoïdes versus non mucoïdes n’est pas significativement différente
par la technique de coloration au CV. Cette différence devient significative après 48 h.
Aucune corrélation ne peut être établie entre la sensibilité des souches à la tobramycine et leur
capacité à former un biofilm important après 24 h (CV) ou à adhérer à une surface (BFRT ).
Activité protéolytique et élastolytique
L’activité élastolytique diffère au sein des 8 souches étudiées. Les deux souches
secrétant la plus grande quantité d’élastase sont les souches mucoïdes MC75-450457 et
ATCC PAOl. En accord avec ces résultats, ces deux souches sont également parmi les 3
souches ayant la plus grande activité protéolytique. Pratiquement aucune activité élastolytique
n’est détectée chez les autres souches. Les souches MC093-450507, ATCC 9027 et ATCC
15442 présentent une activité protéolytique importante probablement liée à d’autres protéases
que l’élastase.
Production d’AHL
Las et rhl sont 2 systèmes autoinducteurs majeurs contribuant au QS et exprimés par
P. aeruginosa. LasI et RhlI sont les enzymes qui synthétisent 3-oxo-Ci2-HSL et C4-HSL respectivement. Après liaison à leur facteur de transcription respectif (LasR et RhlR), les
AHL activent la transcription de nombreux gènes (plus de 6 % du génome entier pour LasR)
(Schuster et al., 2003). Pour estimer la production de C4-HSL, nous avons utilisé une souche de P. aeruginosa incapable de produire des C4-HSL par absence de rhll. Cette souche surexprime rhlR la rendant très sensible à des C4-HSL exogènes. En réponse à l’activation de RhlR, cette souche environnementale synthétise un pigment bleu facilement détectable.
Quatre souches produisent des quantités importantes de C4-HSL. Il n’y a pas de différence
évidente entre les souches mucoïdes et non mucoïdes. La souche A. tumefaciens
NTL4(pZLR4) utilisée pour détecter Cn>6-HSL a été conçue par Cha et ses collaborateurs (1998). Elle exprime TraR, un facteur de transcription qui, contrairement à LasR et RhlR, est
plutôt non spécifique et répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus long que 4
atomes de carbone (Cha et al., 1998). Ces résultats sont confirmés par CCM. L’analyse des
AHL activant TraR révèle 3 bandes distinctes qui migrent avec 3-oxo-Cg-HSL, 3-oxo-Cio-
HSL et 3-oxo-Ci2-HSL. Ces 3 AHL sont synthétisées par LasI. Il est largement accepté que
les 2 systèmes du QS de P. aeruginosa sont principalement sensibles à C4-HSL (RhlR) et à Cio- et 3-0X0-C12-HSL (LasR). Le rôle de 3-oxo-Cg-HSL ou 3-oxo-Cio-HSL reste incertain. Il a été rapporté récemment que la sensibilité de P. aeruginosa à 3-OXO-C9- ou 3-oxo-Cio-HSL est régulée par la pompe à efflux MexAB-OprM (Minagawa et al., 2012). Cette pompe permet
Caractérisation phénotypique des souches
peuvent contribuer à l’accumulation intracellulaire de 3-oxo-Cio-HSL à des concentrations
suffisantes pour activer LasR. Le 3-oxo-Cg-HSL qui diffuse hors de la bactérie, pourrait
interagir avec des protéines transcriptionnelles d’autres bactéries à Gram négatif pourvues
d’un régulateur de la transcription sensible à cette molécule et contribuer au développement
de biofilms multi-espèces (Riedel et al., 2001).
Séquençage
Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR,
sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé 4 gènes du système : les gènes
lasi, lasR, rhll et rhlR. L’analyse des séquences des 4 gènes révèle de fortes analogies avec la
souche P. aeruginosa LESB58. La souche hypervirulente LESB58 a été identifiée pour la
première fois en 1996 chez des patients atteints de mucoviscidose (Cheng et al., 1996). Nos
résultats suggèrent que 7 souches étudiées dans ce travail sont probablement dérivées de la
souche P. aeruginosa LESB58. Trois gènes de ces 7 souches (lasl, rhll et rhlR) sont très
similaires aux gènes de la souche LESB58. LasR est le seul gène avec des mutations affectant
la structure de la protéine. Ces résultats sont cohérents avec des observations rapportant que
les souches cliniques de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose montrent
un grand taux de mutations du gène lasR : après colonisation des poumons de ces patients, 60
% des isolats portent une mutation de lasR (Smith et al., 2006). Dans notre étude, 2 souches
(PYOl et MC099-450467) ont des mutations provoquant une altération majeure de la protéine
(codon STOP prématuré et expression d’une protéine raccourcie ; décalage du cadre de
lecture et changements dans la structure primaire de la protéine). Ces altérations majeures de
LasR pourraient expliquer la faible quantité d’AHL produites par les souches PYOl et
MC099-450467 (plus d’amplification du système par auto-induction). Trois autres souches
ont une mutation faux sens dans l’hélice-a impliquée dans la liaison de LasR à l’ADN
(Bottomley et al., 2007). Une de ces mutations (V208M dans la souche MC093-450507)
affecte un résidu conservé mais le rôle de cette valine n’a pas été défini (Bottomley et al.,
2007). Sa substitution par un autre acide aminé hydrophobe ne devrait pas affecter l’activité
de la protéine. Les deux autres mutations concernent la méthionine 212. Cet acide aminé
appartient à une hélice-a interagissant avec l’ADN (Bottomley et al., 2007). Il est substitué
soit par une valine, un autre acide aminé hydrophobe (ATCC 15442), soit par une thréonine,
un résidu polaire (ATCC 9027). Cette mutation peut expliquer la faible quantité d’AHL
observée avec cette souche. Deux gènes lasR sont amplifiés dans la souche de référence
ATCC PAOl. Un de ces gènes a une délétion qui recouvre la majeure partie du fragment
amplifié. L’expérience est répétée avec une autre souche ATCC PAOl obtenue par le Dr O.
Vandeputte (Vandeputte et al., 2011). Seul un amplicon lasR est observé avec cette souche
(données non montrées) confirmant qu’une mutation est apparue dans notre souche ATCC
PAOl pendant la conservation. Des mutations spontanées de la souche ATCC PAOl
apparaissant après plusieurs passages ont été décrites par Klockgether et al. (2010). Sandoz et
al. (2007) suggèrent que ces mutations apparaissent sous des conditions dans lesquelles les
nutriments sont en abondance et les signaux de QS absents. D’après ces auteurs, une souche
compétente en QS et une souche déficiente en QS, souche « tricheuse », pourraient coexister
dans une population hétérogène.
Corrélations AHL et phénotype
La présence d’AHL dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose et
infectés par P. aeruginosa a été remarquée pour la première fois par Singh et al. (2000). Ces