ILll.2.2 Etude sur un biofilm préformé dans une microplaque
IL 12.3 Evaluation de Vactivité mitochondriale (test MTT)
Principe
L’ajout d’un sel de tétrazolium, le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-
diphényl tétrazolium (MTT), dans le milieu de culture permet de quantifier l’activité
mitochondriale des cellules et donc d’estimer la viabilité cellulaire. Lors d’une activité
mitochondriale efficace, l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase réduit le MTT
soluble en cristaux de formazan insolubles en milieu aqueux. La quantification de cristaux de
formazan, par mesure de l’absorbance, est proportionnelle au nombre de cellules
métaboliquement actives.
Protocole expérimental
La toxieité mitochondriale des produits à tester (CSA-13, seul ou en présence d’acide
pluronique F-127 6 % et peptides) est évaluée par un test colorimétrique MTT. Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de
CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées une nuit à une
concentration de 1.10^ eellules/mL dans une plaque 96-puits dans leur milieu de eulture. Le
Matériel et Méthodes
produit à tester. Les cellules sont incubées pendant 20 min à 37 °C. Après incubation, le
milieu est écarté et les puits sont remplis par 100 pL d’une solution de MTT à 1 mg/mL. La
plaque est incubée à 37 °C pendant 3 h 30. Les cristaux de formazan formés par les cellules
sont solubilisés à l’aide de DMSO et l’absorbance est lue dans notre lecteur de microplaques à
540 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’absorbance mesurée dans les
conditions contrôles (absence des produits à tester).
II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial
Principe
Le tétraméthylrhodamine éthyl ester (TMRE) est un agent fluorescent s’accumulant au
sein des mitochondries intactes selon le potentiel électrique de la membrane mitochondriale
interne. Le potentiel de membrane mitochondrial est un composant important de la force
promotrice responsable de la synthèse d’ATP par la mitochondrie. Les cellules possédant un
potentiel de membrane mitochondrial négatif et incubées en présence de TMRE accumulent
ce dernier dans leurs mitochondries intactes (Scaduto et Grotyohann, 1999) et une
augmentation de la fluorescence est détectée. En cas de dissipation du potentiel de membrane
mitochondrial, l’accumulation de TMRE dans la mitochondrie est entravée et on observe une
diminution de la fluorescence cellulaire.
Protocole expérimental
La mesure du potentiel de membrane mitochondrial après traitement par le CSA-13,
seul ou en présence du dérivé pluronique F-127, est évaluée sur les cellules HUVEC selon le
protocole décrit par Date et al. (2005). Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques
T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont détachées par 10
% de trypsine-EDTA et incubées une nuit dans une plaque 24-puits à une confluence de 50 à
60 %. Le lendemain, le milieu de culture est aspiré et les cellules adhérentes sont mises en
présence de 1 mL des différentes concentrations en CSA-13, seul ou en association avec le
dérivé pluronique F-127 à 5 %, pendant 1 h à 37 °C. Le CSA-13 et Tacide pluronique F-127
sont dilués dans un tampon PBS à différents pH (pH 6, 7 et 8) afin d’étudier l’influence du pH sur l’effet du CSA-13. A la fin de l’incubation, le milieu est aspiré et les cellules sont
exposées à 200 nM de TMRE pendant 1 h à 37 °C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec
un tampon PBS. Un mL de Triton X-100 1 % (yiW) est ajouté aux puits afin de lyser les
cellules. Deux cent piL sont prélevés et mis en plaque 96-puits à fond noir. La fluorescence est
lue à l’aide de notre lecteur de microplaques aux longueurs d’ondes d’excitation et d’émission
de 544 nm et 590 nm respectivement.
11.13 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A
L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE
FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR)
11.13.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls
Préparation de la solution des peptides
La synthèse des peptides est suivie d’une étape de purification des peptides par
chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse à l’aide d’un
gradient d’acétonitrile contenant 0,1 % d’acide trifluoroacétique (den Hertog et al., 2006).
Des traces de trifluoroacetate (CF3COO' ou TFA) peuvent alors être présentes dans les
peptides (résidu de purification). Il est essentiel de pouvoir éliminer ces traces de TFA car ce
dernier présente une forte bande d’absorption à 1673 cm'* qui peut chevaucher ou même
masquer la bande de l’amide I du peptide (Zhang et al., 1995). Afin d’éliminer toute trace de
TFA ou d’acétonitrile susceptible d’interférer avec le spectre, les différents peptides subissent
une mise en solution dans 100 pL d’HCl 10 mM suivie d’une congélation et enfin une
lyophilisation (Andrushchenko et al., 2007). L’acide chlorhydrique permet d’éliminer les
contre-ions de TFA" auxquels le peptide est lié à la fin de la synthèse. L’acide chlorhydrique
permet le passage des ions carboxylates en acides carboxyliques (CF3COOH) qui passent en
phase gazeuse et sont éliminés. Ce cycle est opéré 2 fois. Les peptides sont ensuite suspendus
dans 3 à 6 pL d’un tampon HEPES 1 mM à pH 7,3 à une concentration finale de 1 pM.
Enregistrement des spectres en présence d’eau d’hydratation
Un pL de la solution de peptide est étalé sur le cristal de diamant, l’excès d’eau est
rapidement évaporé sous flux d’azote sec et le spectre est analysé comme décrit par Vigano et
al. (2000). Les spectres sont obtenus à l’aide d’un spectrophotomètre Bruker IFS 55 FTIR
(Bruker, Ettlingen, Allemagne), équipé d’un détecteur mercure cadmium tellure (MCT)
Matériel et Méthodes
Enregistrement des spectres après échange H2O/D2O « deutération »
L’échange hydrogène/deutérium (H/D) est réalisé comme décrit par Vigano et al.
(2000). L’échantillon est soumis à un courant d’azote saturé en vapeur de D2O à température ambiante. L’échange est observé par la diminution de l’intensité du pic de l’amide 11 autour
de 1550 cm”' qui est sensible à l’échange H/D en comparaison avec l’aire du pic de l’amide 1
(région 1600-1700 cm"') pris comme référence. Des temps de deutération assez courts sont
généralement suffisants pour déplacer les composants non structurés de l’amide 1, tandis que prolonger la deutération, affectant les composants des structures ordonnées, ne modifie pas
significativement la position de leurs constituants (Goormaghtigh et al., 1994a - 1994b).
Enregistrement des spectres après reconstitution dans une solution de D2O
Des expériences similaires sont réalisées après reconstitution des peptides dans une
solution de D2O. Pour ce faire, après lyophilisation des peptides ceux-ci sont solubilisés à
l’aide d’une solution de D2O pendant 1 h afin que l’échange H/D soit pratiquement total à
l'exception des groupes difficilement échangeables. Un qL des peptides saturés en D2O est
déposé sur le cristal de diamant. Les spectres sont obtenus après élimination rapide de l'excès
de D2O sous flux d'azote sec avant d'être soumis à un équilibrage avec de l'azote saturé en vapeur de D2O à température ambiante.
II.13.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes
Préparation des liposomes
Les liposomes sont préparés comme suit : 1,4 mg de La-Phosphatidylcholine (PC) et
0,6 mg de Palmitoyl-2-01eoyl-5n-Glycero-3-[Phospho-rac-(l-glycerol)] (POPG) sont dissous
dans 500 pL de chloroforme et séchés sous un flux léger d’azote. Lorsque l’échantillon est
sec, il est placé sous vide afin d’éliminer toute traee de solvant. Après scellage sous azote,
l’échantillon est conservé à -20 °C. Le jour de la prise des spectres, le mélange de lipides est
dispersé dans un tampon HEPES 1 mM (pH 7,3) à une concentration finale de 2 mg/mL soit
~3 mM (PM -700 g/mol).
Enregistrement des spectres après reconstitution dans une solution de D2O
Les spectres sont enregistrés après reconstitution des peptides et lipides dans une
solution de D2O. Pour ce faire, après lyophilisation du peptide ou séchage du mélange de
Représentation schématique du mécanisme de liaison de la dansyl-PMB à des micelles de LPS. Le faible rendement de fluorescence de la fraction dansyle dans un environnement polaire est considérablement accru en milieu apolaire, comme lorsqu'elle est liée. La réduction de la fluorescence lors de l'addition d'un ligand de compétition cationique (comme la PMB) est secondaire au déplacement de la dansyl-PMB. Ce déplacement peut être interprété pour décrire l’affinité de liaison à un ligand compétiteur (Soon et al., 2011).
Matériel et Méthodes
lipides, le résidu sec est reconstitué dans une solution de D2O pendant 1 h afin que l’échange H/D soit optimal. Après dépôt sur le cristal de diamant et élimination de l’excès de D2O sous flux d'azote sec, l’échantillon est soumis à un équilibrage avec de l'azote saturé en vapeur de
D2O à température ambiante et les spectres sont enregistrés.
11.14 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS
Principe
La polymyxine B (PMB) est un antibiotique peptidique cyclique et cationique qui se
lie aux lipides anioniques. La PMB se lie aux LPS, des composants de la membrane externe
des bactéries à Gram négatif. La dansyl-polymyxine B (dansyl-PMB), dont la fluorescence est
faible lorsqu’elle est en solution, devient fortement fluorescente lorsqu’elle se lie aux LPS. La
liaison de la dansyl-PMB aux LPS peut être déplacée par de nombreux antibiotiques
cationiques. Des études de compétition de la liaison de la dansyl-PMB peuvent donc être
réalisées afin d’évaluer la liaison de composés, comme les PAM cationiques, aux LPS.