Chapitre II. La thérapie photodynamique
II.3. Les réactions photochimiques
La terminologie "action photodynamique" en photothérapie est réservée aux PS
consommant de l’oxygène moléculaire. Les acteurs essentiels de la PDT à visée anticancéreuse
sont au nombre de 3 : le PS, la lumière et l’oxygène (Figure 20) (29).
Figure 20 : les 3 fondamentaux de la thérapie photodynamique
Une fois activé par la lumière, le photosensibilisateur est capable d’induire des réactions chimiques oxydatives à l’origine de la destruction de la tumeur.
Lorsque le PS est excité par absorption de la lumière, il va passer de son état
fondamental, c’est à dire de l’état stable (P0 ou S0) à un état singulet excité de haute énergie
(
nP
*ou Sn) mais de très courte durée de vie, environ 10
-15s. Le PS va ensuite être stabilisé par
conversion interne à un niveau d’excitation de plus faible énergie (
1P
*ou S1).
Chloë FIDANZI-DUGAS | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 50
vaginales (31), en urologie dans les cancers de la vessie (32), en pneumologie dans les cancers pulmonaires (33), ou encore dans les cancers de la tête et du cou (34). La PDD est utile pour la surveillance de ces tumeurs malignes en permettant une détection précoce avant la visualisation de
lésions macroscopiques et donc permet d’optimiser les traitements et d’améliorer les pronostics. La PDT thérapeutique, quant à elle, est basée sur l’activation par une lumière visible (souvent la lumière rouge) d’un agent photosensibilisant se fixant sélectivement sur la tumeur et aboutissant à
une destruction sélective du tissu néoplasique par un mécanisme d’oxydation irréversible (35).
Selon le mode d’administration du PS, deux types de PDT existent : la PDT topique utilisant un
PS en application locale (crème, émulsion, solution, injection sous-cutanée) et la PDT systémique pour laquelle le PS est administré par voie intraveineuse ou par voie orale. Dans les deux cas, après administration, le PS est concentré sélectivement au sein du tissu cancéreux ; puis, une stimulation
lumineuse active le PS à l’origine de réactions photochimiques induisant ainsi la mort des cellules
tumorales.
Contrairement à la PDT topique, la PDT systémique présente une faible sélectivité du PS à
l’origine d’une photosensibilité généralisée et prolongée des patients traités (36), du fait de
l’accumulation du PS dans la peau. C’est pourquoi, les avantages de la PDT topique ont permis de
nouvelles perspectives d’utilisation de la PDT dans de nombreux domaines médicaux et chirurgicaux, notamment en cancérologie et de manière très logique en dermatologie.
Néanmoins, du fait du large éventail d’avantages de la PDT face aux thérapies anticancéreuses
actuelles, la recherche tend à améliorer la sélectivité des PS en vue d’étendre les champs d’application de la PDT aux tumeurs solides plus profondes.
II.2. Les réactions photochimiques
En photobiologie et en photomédecine, la terminologie « action photodynamique » est réservée aux photosensibilisations consommant de l’oxygène moléculaire. Les acteurs clés de la PDT sont
donc au nombre de 3 : le photosensibilisateur (PS), la lumière et l’oxygène(Figure I-20).
Figure I- 20- Principe général de la PDT.
Une fois activé par la lumière, le photosensibilisateur est capable d’induire des réactions chimiques oxydatives à l’origine
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 53 Licence CC BY-NC-ND 3.0
L’excès d’énergie pour permettre le retour du PS à son état fondamental stable est restitué selon
3 mécanismes :
• Par dégagement de chaleur ;
• Par transition radiative (S1 → S0) avec émission de photons de fluorescence utilisés
pour le PD ;
• Par transition non radiative à un état intermédiaire, l’état excité triplet utilisé pour la
PDT.
En effet, il est possible que le PS par conversion intersystème puisse rejoindre un état
excité triplet de plus faible énergie (
3P
*ou T1), mais d’une durée de vie plus longue, d’environ
10
-6à 1 s, lui permettant d’interagir avec les substrats situés dans son environnement proche.
Lors d’absence de substrat comme l’oxygène par exemple, le PS peut retourner à son état
fondamental par transition radiative (T1 → S0) avec émission de phosphorescence. En revanche,
en présence d’oxygène, deux réactions dites de type I ou II peuvent entrer en compétition et
conduire à des cascades de réactions oxydatives à l’origine de la destruction des cellules
cancéreuses (Figure 21) (30).
Figure 21 : diagramme de Jablonski
Par absorption de lumière, le PS va passer de son état fondamental (P0) à son état excité (nP*) puis, par conversion interne, à un niveau d’excitation singulet de plus faible énergie (1P*) qui par transition intersystème, peut rejoindre un état triplet (3P*) qui va conduire à la production d’espèces réactives de l’oxygène. Source : manuscrit de thèse Chloé Fidanzi-Dugas, 2016
II.3.1.Les réactions photochimiques de type I
Les réactions photochimiques de type I consiste en la réaction directe du PS à l’état
excité avec des substrats biologiques (S) par transfert d’électrons ou d’atomes d’hydrogène à
l’origine de la production d’espèces radicalaires (31).
Chloë FIDANZI-DUGAS | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 51
La photosensibilisation du PS par absorption de lumière (h ) va induire le passage du PS de son état fondamental (P0) à un état singulet excité (nP*) de courte durée de vie. Le PS va être stabilisé
par conversion interne (IC) à un niveau d’excitation singulet de plus faible énergie (1P*) et de plus
courte durée de vie. L’excès d’énergie est restitué par le PS selon 3 mécanismes : un dégagement de chaleur,
une émission de photons de fluorescence (utilisée pour le photodiagnostic),
le passage à un état intermédiaire dit « état triplet » (utilisé pour la photothérapie).
En effet, c’est uniquement lorsqu’il rejoint un état triplet de plus faible énergie (3P*) par transition intersystème (ISC) que le PS acquiert une durée de vie plus longue pouvant ainsi induire deux réactions dites de type I et II qui vont entrer en compétition et pouvoir induire des cascades de
réactions à l’origine de la destruction de la tumeur(Figure I-21). P0→ nP* → 1P* → 3P*
Figure I- 21- Diagramme de Jablonski.
Par absorption de lumière, le PS va passer de son état fondamental (P0) à son état excité (nP*) puis, par conversion interne (IC), à un niveau d’excitation singulet de plus faible énergie (1P*) pour enfin, par transition intersystème, rejoindre un état triplet (3P*).
II.2.1. Les réactions photochimiques de type I
Selon Foote (37), les réactions photochimiques de type I consiste en l’interaction directe du PS
à l’état excité avec le substrat (S): un transfert d’électron ou d’hydrogène à l’origine de la production de radicaux libres ou d’ions radicalaires pouvant intervenir dans d’autres réactions(Figure I-22).
Les formes oxydées du PS (P•) ou du substrat (S•) tout comme leurs formes semi-réduites (P• -et S•-) peuvent interagir avec l’oxygène moléculaire présent et former respectivement des radicaux peroxydes à l’origine d’une chaine d’auto-oxydation et de l’anion superoxyde (02•-). Une fois formé,
l’anion superoxyde peut interagir avec d’autres substrats pour former d’autres espèces réactives de l’oxygène telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle •OH.
Bien que l’oxygène ne soit pas impliqué dans la première étape du mécanisme, sa présence influence fortement les réactions chimiques qui induisent la formation de ces espèces réactives de
l’oxygène qui sont de puissants oxydants pour de nombreuses biomolécules (cholestérol, certains acides aminés).
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Les formes oxydées du PS (P
•) ou du substrat (S
•) ainsi que leurs formes semi-réduites (P
•-et
S
•-) peuvent réagir avec l’oxygène moléculaire environnant et former respectivement des
radicaux peroxydes à l’origine d’une chaine d’auto-oxydation et de l’anion superoxyde (02
•-)
(Figure 22). Bien que cette espèce ne soit pas particulièrement réactive, elle peut interagir avec
d’autres substrats pour former d’autres espèces réactives de l’oxygène (ERO) tels que le radical
hydroperoxyle (HO2
•), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (
•OH). Les ERO
sont de puissants oxydants pour de nombreuses biomolécules induisant ainsi des réactions
cytotoxiques. Dans les réactions photochimiques de type I, l’oxygène n’est pas impliqué dans
la première étape du mécanisme cependant il influence fortement les réactions chimiques
suivantes afin de permettre la production d’ERO.
Figure 22 : les réactions photochimiques de type I
Les transferts entre le photosensibilisateur et un substrat peuvent être à l’origine de la formation d’espèces réactives de l’oxygène telles que l’anion superoxyde (02•-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (•OH).
II.3.2.Les réactions photochimiques de type II
Dans les réactions photochimiques de type II, cette fois-ci l’oxygène entre en réaction
dès la première étape du processus. En effet, l’excès d’énergie du PS à l’état triplet est transféré
directement à l’oxygène moléculaire induisant le retour du PS à son état fondamental stable et
surtout à la formation de l’oxygène singulet (
1O2) (Figure 23).
Figure 23 : les réactions photochimiques de type II
L’oxygène singulet est capable d’oxyder de nombreuses biomolécules de la cellule
entraînant la dégradation d’un grand nombre de constituants cellulaires et donc par conséquent
sa mort. En effet, les triacylglycérols saturés, les phospholipides ou le cholestérol des
membranes constituent une part importante des substrats de l’oxygène singulet. De plus, les
acides aminés comme notamment le tryptophane, l’histidine et la méthionine ou les acides
nucléiques sont très sensibles à l’oxydation (Figure 24) (32,33).
Chloë FIDANZI-DUGAS | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 52 Etape 1 : 3P*+ S → P•+ + S•- ou 3P*+ S → P•- + S•+
Etape 2 : P•- (ou S•-) + O2 → P (ou S) + O2• -Etape 3 : O2•- + H+→ HO2•
HO2• + O2•- + H+→ H2O2 + O2 H2O2 + O2•-→ •OH + OH- + O2
Figure I- 22- Les réactions photochimiques de type I.
Les transferts entre le PS et un substrat peuvent être à l’origine de la formation d’espèces réactives de l’oxygène telles que l’anion superoxyde (02•-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (•OH).
II.2.2. Les réactions photochimiques de type II
Dans les réactions photochimiques de type II, l’oxygène entre en réaction dès la première étape du processus. En effet, un transfert d’énergie s’effectue du PS à l’état triplet vers l’oxygène
moléculaire induisant le retour du PS à son état fondamental et la formation d’oxygène singulet (1O2). 3P*+ O2→ P + 1O2
L’oxygène singulet est capable d’oxyder de nombreuses biomolécules présentes dans la cellule. En effet, les acides aminés étant très sensibles à l’oxydation, notamment la cystéine, la
tyrosine et le tryptophane, les protéines représentent des cibles primordiales de l’oxygène singulet. C’est aussi le cas des lipides insaturés comme les acides gras polyinsaturés qui constituent une part
importante des substrats de l’1O2 généré dans les structures membranaires.
La réaction d’oxydation des biomolécules par l’1O2 est très rapide conférant ainsi à l’1O2 une demi-vie très courte (4µs dans l’eau et probablement plus courte dans la cellule) (38). Le site
intracellulaire de localisation du PS apparait donc déterminant quant au site de formation de l’1O2 : la
réponse de la cellule suite à la génération et à la réaction de l’1O2 est dépendante du site de formation
de l’1O2 ; on parle de « réponse cellulaire à l’1O2 résolue dans l’espace ». Cet espace subcellulaire, dans lequel se situe sélectivement le PS, peut être la totalité ou une partie d’un organite, une structure
(membrane, microtubules) ou le proche environnement d’une protéine cible. Par exemple, le type de
mort cellulaire induit par la PDT est fonction du site de localisation du PS : un photosensibilisateur présent au niveau de la mitochondrie, du réticulum endoplasmique, ou encore des lysosomes va
préférentiellement induire un phénomène de mort cellulaire programmée ou apoptose, alors qu’un
photosensibilisateur situé au niveau de la membrane plasmique induit plutôt un mécanisme non-apoptotique (39).
Cette terminologie « type I et type II » ne s’applique qu’aux réactions primaires qui découlent de l’excitation du PS. En effet, les radicaux formés par les réactions de type I peuvent également se former après une réaction de type II et induire une réponse cellulaire : l’1O2 formé par les réactions de type II, en réagissant avec les protéines ou les lipides insaturés, peut produire des hydroperoxydes qui peuvent être convertis en espèces radicalaires qui ont une durée de vie plus longue, qui peuvent diffuser à distance dans la cellule et produire des dommages oxydants majeurs (38) (Figure I-23).
Figure I- 23– Relation entre la durée de vie, la réactivité et la distance de diffusion des ROS.
Chloë FIDANZI-DUGAS | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 52 Etape 1 : 3P*+ S → P•+ + S•- ou 3P*+ S → P•- + S•+
Etape 2 : P•- (ou S•-) + O2 → P (ou S) + O2• -Etape 3 : O2•- + H+→ HO2•
HO2• + O2•- + H+→ H2O2 + O2 H2O2 + O2•-→ •OH + OH- + O2
Figure I- 22- Les réactions photochimiques de type I.
Les transferts entre le PS et un substrat peuvent être à l’origine de la formation d’espèces réactives de l’oxygène telles que l’anion superoxyde (02•-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (•OH).
II.2.2. Les réactions photochimiques de type II
Dans les réactions photochimiques de type II, l’oxygène entre en réaction dès la première étape du processus. En effet, un transfert d’énergie s’effectue du PS à l’état triplet vers l’oxygène
moléculaire induisant le retour du PS à son état fondamental et la formation d’oxygène singulet (1O2). 3P*+ O2→ P + 1O2
L’oxygène singulet est capable d’oxyder de nombreuses biomolécules présentes dans la cellule. En effet, les acides aminés étant très sensibles à l’oxydation, notamment la cystéine, la
tyrosine et le tryptophane, les protéines représentent des cibles primordiales de l’oxygène singulet. C’est aussi le cas des lipides insaturés comme les acides gras polyinsaturés qui constituent une part
importante des substrats de l’1O2 généré dans les structures membranaires.
La réaction d’oxydation des biomolécules par l’1O2est très rapide conférant ainsi à l’1O2 une demi-vie très courte (4µs dans l’eau et probablement plus courte dans la cellule) (38). Le site
intracellulaire de localisation du PS apparait donc déterminant quant au site de formation de l’1O2 : la
réponse de la cellule suite à la génération et à la réaction de l’1O2 est dépendante du site de formation
de l’1O2 ; on parle de « réponse cellulaire à l’1O2 résolue dans l’espace ». Cet espace subcellulaire, dans lequel se situe sélectivement le PS, peut être la totalité ou une partie d’un organite, une structure
(membrane, microtubules) ou le proche environnement d’une protéine cible. Par exemple, le type de
mort cellulaire induit par la PDT est fonction du site de localisation du PS : un photosensibilisateur présent au niveau de la mitochondrie, du réticulum endoplasmique, ou encore des lysosomes va
préférentiellement induire un phénomène de mort cellulaire programmée ou apoptose, alors qu’un
photosensibilisateur situé au niveau de la membrane plasmique induit plutôt un mécanisme non-apoptotique (39).
Cette terminologie « type I et type II » ne s’applique qu’aux réactions primaires qui découlent de l’excitation du PS. En effet, les radicaux formés par les réactions de type I peuvent également se former après une réaction de type II et induire une réponse cellulaire : l’1O2 formé par les réactions de type II, en réagissant avec les protéines ou les lipides insaturés, peut produire des hydroperoxydes qui peuvent être convertis en espèces radicalaires qui ont une durée de vie plus longue, qui peuvent diffuser à distance dans la cellule et produire des dommages oxydants majeurs (38) (Figure I-23).
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Figure 24 : exemples d’oxydation et de cycloaddition des composants cellulaires menant à la destruction de la tumeur
Source : adapté de Kulig et al., 1973 (32) et Baptista et al., 2017 (33)
L’oxygène singulet a une très forte réactivité mais une durée de vie très courte limitant
fortement la zone de réaction puisqu’il parcourt environ 10 nm dans la cellule. Le site
intracellulaire de localisation du PS est donc déterminant dans la réponse cellulaire attendue.
En effet, le type de mort cellulaire induit par la PDT est dépendant du site de localisation du
PS. Un PS présent au niveau des organites cellulaires comme la mitochondrie, le réticulum
endoplasmique (RE) ou les lysosomes va préférentiellement induire une mort cellulaire
programmée ou apoptose alors qu’un PS situé au niveau membranaire induira plutôt un
mécanisme non-apoptotique (34). La compétition entre ces 2 types de réaction est contrôlée
notamment par la nature du PS et la concentration en oxygène. On parle de type I et type II
uniquement pour les réactions primaires qui découlent de l’excitation du PS. En effet, les ERO
formées après les réactions de type I peuvent également se former à la suite de réactions de type
II. L’oxygène singulet en réagissant avec les biomolécules cellulaires peut produire des
hydroperoxydes qui peuvent être convertis en espèces radicalaires. Parmi ces ERO, l’oxygène
singulet possède une très forte réactivité mais une durée de vie très faible limitant sa distance
de diffusion dans la cellule. En revanche, d’autres espèces comme l’anion superoxyde ou le
peroxyde d’hydrogène possèdent une durée de vie plus longue leur permettant de diffuser à
distance dans la cellule et de produire des dommages oxydants plus étendus (Figure 25) (35).
Cependant, l’oxygène singulet peut également réagir avec le PS en le détruisant par ouverture
de ces macrocycles, on parle de photo-blanchiment.
H+ H2O2 + O2 O2-° HOO° pKa = 4.16 Fig. 10 + Photoréaction de type II :
L’état triplet T1 réagit directement avec l’oxygène en lui transférant son excès d’énergie, qui fait passer l’oxygène 3O2 à son état singulet 1O2.
L’ensemble de ces processus entraîne la dégradation d’un grand nombre de constituants cellulaires conduisant à la mort cellulaire par nécrose ou plus souvent par apoptose.
La compétition entre ces deux mécanismes est contrôlée par plusieurs paramètres tels la nature du sensibilisateur et la concentration en oxygène.
Des études ont montrées que le mécanisme de type II est prédominant en PDT des porphyrines.
A noter que l’oxygène singulet formé peut réagir avec le Ps et le détruire par ouverture du macrocyle. Cette dégradation, appelée photobleaching est une conséquence des réactions de type I et II.
c) Le rôle de l’oxygène singulet en PDT
L’oxygène singulet 1O2, formé par l’action combinée d’un photosensibilisateur, de lumière et d’oxygène, est un puissant oxydant qui réagit avec de nombreux constituants cellulaires tels les triacyles glycérols saturés, le cholestérol des membranes, les
phospholipides, les acides aminés (histidine, tryptophane, méthionine) et les acides nucléiques : O H C8H17 N H NHR CO2R O H C8H17 OOH N H NHR CO2R O O N H N NH N O N H2 N H N NH N O N H2 O O 1O2
Cholestérol
Tryptophan
Guanine
1O2 1O2Fig. 11 : exemples d’oxydation et de cycloaddition des composants cellulaires menant à la destruction de la tumeur.
De par sa durée de vie très courte et sa forte réactivité, 1O2 réagit sur son lieu de formation dans la cellule (parcourt libre moyen 0,01 – 0,02 µm). L’activité photocytotoxique dépendra d’une part de la combinaison des rendements quantiques de formation de l’état S1, de la
-Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 56 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Figure 25 : relation entre la durée de vie, la réactivité et la distance de diffusion des espèces réactives de l’oxygène