Analyse quantitative des caspases 3/7 activées après inhibition de l’autophagie

Afin de confirmer le rôle de résistance de l’autophagie à l’apoptose dans cette étude,

l’étude des évènements plus tardifs de l’apoptose après inhibition de l’autophagie a ainsi été

réalisée. L’analyse quantitative des caspases 3/7 activées a été étudiée après traitement ou non

des cellules avec la 3-MA grâce au système d’analyse sur cellules vivantes IncuCyte

S3

pendant 48 h (Figures 121-123).

Les cellules (HCT116, HT-29 et SW620) ont été ensemencées selon la densité

déterminée et cultivées pendant 24 h dans du milieu correspondant. Les cellules ont ensuite été

traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs aux IC50 déterminées. Après 24 h d’incubation, le

milieu a été remplacé par du milieu correspondant dépourvu de rouge de phénol, les cellules

ont été traitées ou non avec la 3-MA, puis les cellules ont été irradiées ou non. Les cellules ont

ensuite été traitées avec le réactif vert caspase 3/7 et placées dans le système d’analyse sur

cellules vivantes IncuCyte

S3. Toutes les 2 h et pendant 48 h, des images des cellules ont été

prises et la quantité de cellules exprimant une fluorescence verte a été quantifiée au cours du

temps.

Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 177 Licence CC BY-NC-ND 3.0

Figure 121 : analyse quantitative des caspases 3/7 activées après inhibition de l’autophagie dans les cellules HCT116

Les cellules HCT116 ont été traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs à l’IC50 déterminée pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été traitées ou non avec la 3-MA, irradiées ou non puis traitées avec le réactif vert caspase 3/7 et placées dans le système d’analyse sur cellules vivantes IncuCyte® S3. Toutes les 2 h, des images des cellules ont été prises à hauteur de 4 images par puits en contraste de phase et en fluorescence verte en utilisant l’objectif x10. Des images représentatives sont montrées pour chaque condition de traitement aux temps 0, 24 et 48 h. La barre d’échelle jaune représente 400 μm. La quantité de cellules en apoptose a été quantifiée avec le logiciel IncuCyte® en utilisant le rapport du nombre de cellules fluorescentes en vert normalisé par le nombre de cellules totales dans chaque puits au cours du temps sur 48 h. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM avec n ≥ 3 et ***p < 0,001.

Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 178 Licence CC BY-NC-ND 3.0

Figure 122 : analyse quantitative des caspases 3/7 activées après inhibition de l’autophagie dans les cellules HT-29

Les cellules HT-29 ont été traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs à l’IC50 déterminée pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été traitées ou non avec la 3-MA, irradiées ou non puis traitées avec le réactif vert caspase 3/7 et placées dans le système d’analyse sur cellules vivantes IncuCyte® S3. Toutes les 2 h, des images des cellules ont été prises à hauteur de 4 images par puits en contraste de phase et en fluorescence verte en utilisant l’objectif x10. Des images représentatives sont montrées pour chaque condition de traitement aux temps 0, 24 et 48 h. La barre d’échelle jaune représente 400 μm. La quantité de cellules en apoptose a été quantifiée avec le logiciel IncuCyte® en utilisant le rapport du nombre de cellules fluorescentes en vert normalisé par le nombre de cellules totales dans chaque puits au cours du temps sur 48 h. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM avec n ≥ 3 et ***p < 0,001.

Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 179 Licence CC BY-NC-ND 3.0

Figure 123 : analyse quantitative des caspases 3/7 activées après inhibition de l’autophagie dans les cellules SW620

Les cellules SW620 ont été traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs à l’IC50 déterminée pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été traitées ou non avec la 3-MA, irradiées ou non puis traitées avec le réactif vert caspase 3/7 et placées dans le système d’analyse sur cellules vivantes IncuCyte® S3. Toutes les 2 h, des images des cellules ont été prises à hauteur de 4 images par puits en contraste de phase et en fluorescence verte en utilisant l’objectif x10. Des images représentatives sont montrées pour chaque condition de traitement aux temps 0, 24 et 48 h. La barre d’échelle jaune représente 400 μm. La quantité de cellules en apoptose a été quantifiée avec le logiciel IncuCyte® en utilisant le rapport du nombre de cellules fluorescentes en vert normalisé par le nombre de cellules totales dans chaque puits au cours du temps sur 48 h. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM avec n ≥ 3 et ***p < 0,001.

Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 180 Licence CC BY-NC-ND 3.0

Ces résultats montrent que l’inhibition de l’autophagie par la 3-MA permet de décupler

l’augmentation de la quantité de caspases 3/7 activées induite par les TPPOH-X SNPs-PDT

dans les 3 lignées cellulaires (Figures 121-123). En effet, le traitement des cellules HCT116

avec les TPPOH-X SNPs + 3-MA-PDT entraîne une augmentation significative de plus de 7

fois supérieure par rapport à la condition témoin-lumière à 48 h de la quantité de caspases 3/7

activées au cours du temps (Figure 121). L’inhibition de l’autophagie permet donc de décupler

la quantité de caspases 3/7 activées puisqu’à 48 h, en l’absence de 3-MA, les TPPOH-X

SNPs-PDT n’induisent une augmentation que de 4 fois supérieure à la condition témoin-lumière.

Cependant, cette augmentation de la quantité de caspases 3/7 activées est uniquement due au

rôle de résistance de l’autophagie à l’apoptose et non à la 3-MA elle-même puisque, lors du

traitement des cellules HCT116 avec les TPPOH-X SNPs + 3-MA non photoactivées, aucune

augmentation de la quantité de caspases 3/7 activées n’est observée par rapport à la condition

témoin-lumière. Des résultats similaires sont observés pour les cellules HT-29 (Figure 122) et

SW620 (Figure 123) où le co-traitement avec la 3-MA des cellules traitées avec les TPPOH-X

SNPs-PDT permet l’augmentation significative de la quantité de caspases 3/7 activées,

respectivement de plus de 12 et 7 fois supérieure par rapport à la condition témoin-lumière

contre seulement plus de 4 fois supérieure sans traitement avec la 3-MA. De plus, le

co-traitement avec la 3-MA lui-même, n’induit pas l’activation des caspases 3/7 puisque lorsque

les cellules sont traitées avec les TPPOH-X SNPs + 3-MA non photoactivées, il n’y a pas

d’augmentation de la quantité de caspases 3/7 activées par rapport à la condition

témoin-lumière.