Chapitre II. Expérimentations in vivo
II.5. Déclaration éthique
L’approbation du comité d’examen institutionnel a été obtenue du Comité régional
d’éthique de l’expérimentation animale (numéro d’approbation : #16335-2018073009499570
v3). Toutes les expériences in vivo et les protocoles expérimentaux ont été conformes aux
recommandations de la directive européenne du 22 septembre 2010 (2010/63/UE) sur la
protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Tous les efforts ont été mis en œuvre
pour réduire le nombre d’animaux utilisés et pour garantir des conditions optimales de
bien-être avant, pendant et après chaque expérience.
II.6. Analyses statistiques
Tous les résultats quantitatifs sont exprimés comme la moyenne ± l’erreur type de la
moyenne (SEM) d’analyses distinctes. La significativité statistique a été évaluée grâce au test
de Student bilatéral non-apparié et exprimée selon *p < 0,05 ; **p < 0,01 et avec NS considéré
comme non significatif. Toutes les expériences ont été réalisées sur au moins 3 souris.
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 129 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 130 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Chapitre I. Expérimentations in vitro
I.1. Étude de la viabilité cellulaire
Afin d’étudier la phototoxicité des molécules in vitro, les cellules (HCT116, HT-29 et
SW620) ont été ensemencées selon la densité déterminée et cultivées pendant 24 h dans du
milieu correspondant. Les cellules ont ensuite été traitées ou non par une gamme de
concentrations croissantes avec la TPPOH libre, les TPPOH-X SNPs ou les SNPs. Après 24 h
d’incubation, le milieu a été remplacé par du milieu correspondant dépourvu de rouge de phénol
puis les cellules ont été irradiées ou non. La viabilité des cellules a alors été analysée 48 h après
l’irradiation par le test au MTT (Figures 69-71). Les IC50 pour chaque molécule et chaque
lignée cellulaire ont ensuite été calculées en vue de les comparer (Figure 72).
Figure 69 :effet de la TPPOH libre, des TPPOH-X SNPs et des SNPs sur la viabilité des cellules HCT116
A : Les cellules HCT116 ont été traitées ou non avec une gamme de concentrations croissantes de TPPOH libre ou de TPPOH-X SNPs basée sur la concentration en TPPOH (μM). Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La phototoxicité a été déterminée 48 h après irradiation par le test au MTT. La viabilité cellulaire de chaque condition est exprimée en pourcentage en comparaison à la condition témoin. B : Les cellules HCT116 ont été traitées ou non avec une gamme de concentrations croissantes de SNPs ou de TPPOH-X SNPs basée sur la concentration en SNPs (μg/mL). Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La phototoxicité a été déterminée 48 h après irradiation par le test au MTT. La viabilité cellulaire de chaque condition est exprimée en pourcentage en comparaison à la condition témoin. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM avec n ≥ 3 et **p < 0,01 ; ***p < 0,001.
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 131 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Figure 70 : effet de la TPPOH libre, des TPPOH-X SNPs et des SNPs sur la viabilité des cellules HT-29
A : Les cellules HT-29 ont été traitées ou non avec une gamme de concentrations croissantes de TPPOH libre ou de TPPOH-X SNPs basée sur la concentration en TPPOH (μM). Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La phototoxicité a été déterminée 48 h après irradiation par le test au MTT. La viabilité cellulaire de chaque condition est exprimée en pourcentage en comparaison à la condition témoin. B : Les cellules HT-29 ont été traitées ou non avec une gamme de concentrations croissantes de SNPs ou de TPPOH-X SNPs basée sur la concentration en SNPs (μg/mL). Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La phototoxicité a été déterminée 48 h après irradiation par le test au MTT. La viabilité cellulaire de chaque condition est exprimée en pourcentage en comparaison à la condition témoin. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM avec n ≥ 3 et **p < 0,01 ; ***p < 0,001.
Figure 71 : effet de la TPPOH libre, des TPPOH-X SNPs et des SNPs sur la viabilité des cellules SW620
A : Les cellules SW620 ont été traitées ou non avec une gamme de concentrations croissantes de TPPOH libre ou de TPPOH-X SNPs basée sur la concentration en TPPOH (μM). Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La phototoxicité a été déterminée 48 h après irradiation par le test au MTT. La viabilité cellulaire de chaque condition est exprimée en pourcentage en comparaison à la condition témoin. B : Les cellules SW620 ont été traitées ou non avec une gamme de concentrations croissantes de SNPs ou de TPPOH-X SNPs basée sur la concentration en SNPs (μg/mL). Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La phototoxicité a été déterminée 48 h après irradiation par le test au MTT. La viabilité cellulaire de chaque condition est exprimée en pourcentage en comparaison à la condition témoin. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM avec n ≥ 3 et *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001.
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 132 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Figure 72 : tableau récapitulatif des IC50 calculées
Les IC50, exprimées en nM, pour chaque lignée cellulaire et chaque molécule correspondent à la concentration à laquelle seulement 50% des cellules sont viables par rapport aux cellules témoins. Les « fold » représentent le facteur de diminution d’IC50 des TPPOH-X SNPs par rapport à la TPPOH libre après irradiation.
Ces résultats montrent, quel que soit la lignée cellulaire concernée, que la TPPOH libre et
les TPPOH-X SNPs n’induisent pas d’effet phototoxique quand les cellules n’ont pas été
irradiées (Figures 69-71A). La TPPOH libre ou vectorisée répond donc à l’un des critères
idéaux d’un PS, c’est à dire la non-toxicité en absence de lumière. En revanche, lorsque les
cellules ont été irradiées, la TPPOH libre et les TPPOH-X SNPs induisent une diminution
significative de la viabilité cellulaire de façon dose-dépendante sur les 3 lignées cellulaires
(Figures 69-71A). Cependant, les TPPOH-X SNPs-PDT sont beaucoup plus phototoxiques que
la TPPOH libre-PDT puisque des doses plus importantes en TPPOH libre-PDT sont nécessaires
afin de diminuer de 50% la viabilité cellulaire. Afin d’éliminer un potentiel effet des SNPs sur
la viabilité cellulaire, les cellules ont été traitées à des concentrations basées sur la quantité de
SNPs puis irradiées ou non. Les résultats montrent que quel que soit les concentrations testées,
photoactivées ou non, les SNPs seules n’induisent pas de diminution significative de la viabilité
cellulaire sur les cellules HCT116, HT-29 et SW620 (Figures 69-71B).
Afin de comparer la phototoxicité de la TPPOH libre-PDT par rapport aux TPPOH-X
SNPs-PDT pour chaque lignée cellulaire, les IC50 ont ensuite été calculées (Figure 72). Les
IC50 montrent bien que les TPPOH-X SNPs-PDT sont beaucoup plus phototoxiques que la
TPPOH libre-PDT. En effet, pour les cellules HCT116, l’IC50 avec les TPPOH-X SNPs-PDT
est de 72,6 nM contre environ 3 000 nM avec la TPPOH libre-PDT, soit une efficacité de plus
de 40 fois supérieure. La même tendance est observée sur les cellules SW620 où l’IC50 avec les
TPPOH-X SNPs-PDT est de 75,4 nM contre environ 3 000 nM avec la TPPOH libre-PDT, soit
une efficacité de plus de 39 fois supérieure. En revanche, les cellules HT-29 semblent plus
résistantes que les cellules HCT116 et SW620 avec des IC50 plus élevées de l’ordre de 7 fois
pour les TPPOH-X SNPs-PDT avec une valeur de 550 nM et de 2 fois pour la TPPOH
libre-PDT avec une valeur d’environ 6 000 nM. Cependant, l’intérêt de la vectorisation avec les SNPs
reste tout de même très intéressant puisque les TPPOH-X SNPs-PDT présentent une efficacité
de plus de 10 fois supérieure à celle de la TPPOH libre-PDT sur les cellules HT-29.
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 133 Licence CC BY-NC-ND 3.0
I.2. Dosage du taux cellulaire d’espèces réactives de l’oxygène
Comme la mort cellulaire induite par PDT est basée sur la production cellulaire d’ERO,
cette production a été quantifiée dans les cellules HCT116, HT-29 et SW620 selon les
différentes conditions.
Les cellules ont été ensemencées selon la densité déterminée et cultivées pendant 24 h
dans du milieu correspondant. Les cellules ont ensuite été traitées ou non avec la TPPOH libre
ou les TPPOH-X SNPs aux IC50 déterminées. Après 24 h d’incubation, les cellules ont été
marquées avec la DCFDA. Ensuite, le milieu a été remplacé par du milieu correspondant
dépourvu de rouge de phénol puis les cellules ont été irradiées ou non. Afin de confirmer
l’inhibition de la production d’ERO, un prétraitement avec un piégeur d’ERO, la NAC, a été
réalisé alors que le TBHP a lui été utilisé comme témoin positif. La production d’ERO
cellulaires a ensuite été quantifiée par analyse en cytométrie en flux et interprétée grâce aux
médianes d’intensités de fluorescence (MFI) et au % de fluorescence positive (Figures 73-75).
Figure 73 : dosage des espèces réactives de l’oxygène dans les cellules HCT116
A : Les cellules HCT116 ont été traitées ou non avec la TPPOH libre à l’IC50 déterminée. Les cellules ont ensuite été prétraitées ou non avec la NAC et le TBHP puis irradiées ou non. B : Les cellules HCT116 ont été traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs à l’IC50 déterminée. Les cellules ont ensuite été prétraitées ou non avec la NAC et le TBHP puis irradiées ou non. C : Les cellules HCT116 ont été traitées ou non avec la TPPOH libre et les TPPOH-X SNPs aux IC50 déterminées. Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La production d’ERO a ensuite été quantifiée par analyse en cytométrie en flux et interprétée grâce aux MFI et au % de fluorescence positive données dans les tableaux.
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 134 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Figure 74 : dosage des espèces réactives de l’oxygène dans les cellules HT-29
A : Les cellules HT-29 ont été traitées ou non avec la TPPOH libre à l’IC50 déterminée. Les cellules ont ensuite été prétraitées ou non avec la NAC et le TBHP puis irradiées ou non. B : Les cellules HT-29 ont été traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs à l’IC50 déterminée. Les cellules ont ensuite été prétraitées ou non avec la NAC et le TBHP puis irradiées ou non. C : Les cellules HT-29 ont été traitées ou non avec la TPPOH libre et les TPPOH-X SNPs aux IC50 déterminées. Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La production d’ERO a ensuite été quantifiée par analyse en cytométrie en flux et interprétée grâce aux MFI et au % de fluorescence positive données dans les tableaux.
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 135 Licence CC BY-NC-ND 3.0
Figure 75 : dosage des espèces réactives de l’oxygène dans les cellules SW620
A : Les cellules SW620 ont été traitées ou non avec la TPPOH libre à l’IC50 déterminée. Les cellules ont ensuite été prétraitées ou non avec la NAC et le TBHP puis irradiées ou non. B : Les cellules SW620 ont été traitées ou non avec les TPPOH-X SNPs à l’IC50 déterminée. Les cellules ont ensuite été prétraitées ou non avec la NAC et le TBHP puis irradiées ou non. C : Les cellules SW620 ont été traitées ou non avec la TPPOH libre et les TPPOH-X SNPs aux IC50 déterminées. Les cellules ont ensuite été irradiées ou non. La production d’ERO a ensuite été quantifiée par analyse en cytométrie en flux et interprétée grâce aux MFI et au % de fluorescence positive données dans les tableaux.
Ces résultats montrent que, quelle que soit la lignée cellulaire concernée, la TPPOH
libre produit des ERO uniquement lorsqu’elle est photoactivée. En effet, les cellules HCT116
témoins (non traitées et non irradiées) produisent peu d’ERO (MFI = 12,63) par rapport au
témoin positif TBHP (MFI = 103,66) (Figure 73A). Lorsque les cellules HCT116 sont traitées
avec la TPPOH libre et non irradiées, il n’y a pas plus de production d’ERO par rapport à la
condition témoin (MFI = 12,08). En revanche, lorsque les cellules HCT116 sont traitées avec
la TPPOH libre et irradiées, la production d’ERO est augmentée (MFI = 29,69). Lorsque les
cellules HCT116 sont traitées avec la TPPOH libre-PDT en présence de NAC, la production
d’ERO se retrouve à un état proche de la condition témoin (MFI = 8,06). Ces résultats sont
également observés sur les cellules HT-29 (Figure 74A) et SW620 (Figure 75A) où la
production d’ERO n’est augmentée que lors de la photoactivation de la TPPOH libre.
Lorsque la TPPOH est vectorisée, la production d’ERO est également activée
uniquement après photoactivation. En effet, les cellules HCT116 traitées avec les TPPOH-X
SNPs ne produisent que légèrement plus d’ERO (MFI = 59,35) que les cellules HCT116
témoins (MFI = 45,32) et peu par rapport au témoin positif TBHP (MFI = 661,17) (Figure
73B).
Ludovic BRETIN | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2019 136 Licence CC BY-NC-ND 3.0