Les protéines sériques

Les protéines du lactosérum, ou protéines sériques, correspondent aux protéines globulaires du lait, non intégrées au caillé, lors de la fabrication de fromage. Ce sont des protéines toujours solubles (Sliwinski et al., 2003), même à proximité de leur pHi. Cela indique que les répulsions électrostatiques ne sont pas les forces prédominantes dans le contrôle de la solubilité. En effet, ce sont les interactions hydrophobes qui dominent (Roth, 2001). Elles ont des liaisons intramoléculaires principalement formées de ponts disulfures entre les résidus de cystéine. Au-dessus de leur température de dénaturation, elles s’agrègent, c'est-à-dire qu’elles vont former des amas. La liste des principales protéines sériques, classées par teneur décroissante est détaillée ci-après.

a) La β-lactoglobuline (60-65% des protéines totales)

C’est la protéine prédominante du lactosérum, c’est donc principalement elle qui détermine la microstructure engendrée par les protéines (Hongsprabhas & Barbut, 1997a).

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion C’est une protéine globulaire mobile, très soluble et très riche en résidus d’acides aminés indispensables et d’acides aminés sulfatés à très grande valeur nutritionnelle. Sa masse molaire est de 18 200 g/mol, et sa densité de 1,261 g/cm3.

Elle fait partie de la famille des lipocalines. Sa conformation spatiale est un cône, avec un centre hydrophobe (ou calice) au milieu duquel peut se loger un ligand. Ce cœur est formé de 9 feuillets β parallèles et d’une longue hélice α (Zhai et al., 2013). Il sert de site de liaison avec des constituants tels que des acides gras, notamment, dans l’ordre décroissant de leur affinité : les acides palmitique et stéarique mais aussi l’acide myristique et l’acide oléique (Gaucheron, 2004). Elle peut également se lier à du rétinol ou des stéroïdes, ou du calcium. Ce dernier a une constante de dissociation de 3.10-3 M. Cette liaison cœur-ligand est pH-dépendante : plus le pH est élevé, plus la liaison est acerbée (Gaucheron, 2004).

Sa structure secondaire est surtout constituée de feuillets β antiparallèles (40 à 50%), de régions désordonnées (35%) et d’hélices α (10 à 15%). Deux ponts disulfures formant une liaison covalente très solide stabilisent la structure tertiaire. Il existe également un groupe SH (sulfhydrile) libre associé (Nicolai, et al., 2011).

La β-lactoglobuline peut se trouver sous 3 formes : en monomère, en dimère de masse molaire de 26 000 à 37 000 g/mol (Kuhn & Cunha, 2012), ou en octamère. Son association est dépendante du pH, de la température et de l’effet hydrophobe (Lin et al., 2010). Pour un pH compris entre 4 et 6,5, à température ambiante, elle est principalement associée en dimères pseudo-cycliques via des liaisons hydrogènes entre les groupements carboxyles (Ako, 2010). Au-dessus de cette valeur de pH et jusqu’à pH 7, le dimère commence à se dissocier en monomères ; c’est la transition de Tanford (Ako, 2010). A pH neutre, c’est la forme monomère qui est prédominante. Au-dessus de cette valeur, des transformations conformationnelles ont lieu (Roth, 2001). Ces changements de conformation exposent un groupement sulfhydrile, carboxyle et tyrosyle (Ako et al. , 2010). Cette transition a lieu à pH 6 si l’on est à plus de 50 °C. Au-delà de pH 9, cette dissociation se transforme en dénaturation irréversible de la protéine. Ces monomères dénaturés vont alors se regrouper, ce qui assure la protection de leurs sites hydrophobes, et ainsi former des amas (Ako et al., 2010).

Le pHi est la valeur de pH pour laquelle une protéine donnée a une charge nette nulle. Au-dessus de cette valeur de pH, elle est chargée négativement, et au-dessous, positivement. Pour la β-lactoglobuline, le pHi est de 4,83 (Delahaije et al., 2013). Cette protéine a plusieurs régions peptidiques riches en résidus d’acides aminés chargés positivement (arginine, lysine, histidine) ou négativement (acide glutamique et asparagine), presque tous en position exposée (Ako et al., 2010). Autour de pH 7, elle a une charge d’environ -10 mV. Cette charge passe à +20 mV pour un pH de 3,5. La distribution de charge sur le monomère n’est donc pas symétrique de part et d’autre du pHi (Ako et al., 2010). Pour un pH compris entre 6,5 et 7, elle est donc chargée négativement avec une valeur comprise entre 0 et -10 mV ; c’est-à-dire une charge surfacique faible. La répartition des charges est plutôt homogène sur toute la protéine (Donato, 2004).

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion Une dizaine de variants génétiques de la β-lactoglobuline, se différenciant par une substitution de certains acides aminés, existent. Les plus fréquents dans le lait de vache, sont les variants A et B (Nicolai et al., 2011), qui diffèrent l’un de l’autre par deux résidus d’acides aminés (positions 64 et 118). Bien que ces variants ne diffèrent que par deux résidus, la substitution d’un résidu glycine par un résidu d’acide aspartique n’est pas anodine puisqu’elle accroît la possibilité d’un pont salin supplémentaire entre le groupe carboxyle de l’acide aspartique, et un autre groupe basique de l’unité monomère. Il y a donc une augmentation des possibilités d’association du variant A par rapport à celle du variant B (Pessen, Purcell, & Farrell Jr., 1985). Les propriétés de ces deux variants sont différentes : le variant A est plus thermosensible et quatre fois moins soluble que le variant B (Gaucheron, 2004).

b) L’α-lactalbumine (20%)

C’est une petite protéine, de la famille des globulines, riche en résidus d’acides aminés indispensables, de masse molaire d’environ 14 200 g/mol (Nicolai et al., 2011).

Elle possède quatre ponts disulfures, lui permettant d’avoir une structure en forme d’ellipsoïde aplatie. Elle ne possède pas de résidu de cystéine libre, ce qui empêche toute polymérisation. En solution, cette protéine est composée à 30% d’hélices α et à 18% de feuillets β (Zhai et al., 2013). Elle possède deux grands domaines : le premier avec un feuillet β, le second avec 4 hélices α. Un atome de calcium est engagé dans un motif hélice-coude-hélice avec 7 liaisons à des atomes d’oxygène provenant de résidus Asp, Lys et de molécules d’eau. Cette structure stabilise son cœur hydrophobe. Sans calcium, la structure tertiaire est instable, et la thermosensibilité de la protéine augmente, avec une dénaturation à 25 °C au lieu de 66 °C.

Son pHi est de 4,5 (Gaucheron, 2004). Pour un pH inférieur à 4 ou supérieur à 9, le calcium du cœur de la protéine est relargué, ce qui entraîne la dénaturation de la protéine, nommée alors apo-α-lactalbumine. Elle adopte alors un état « molten globule » (Gaucheron, 2004). Entre un pH de 6 et 8,5, l’α-lactalbumine est principalement sous forme de monomère. Sa structure est lâche et flexible (Gaucheron, 2004).

Elle se fixe spécifiquement à certains minéraux tels que le manganèse, le zinc, le sodium, le potassium ou encore le calcium. La constante d’équilibre du complexe calcium/α-lactalbumine (KA), définie par le nombre de complexes qui doivent être formés pour observer un ion métallique libre, est de 2,5.106 M-1 (Gaucheron, 2004).

c) Les protéines mineures (15-20%)

Le glycomacropeptide ou paracaséine κ est un peptide issu de l’hydrolyse de la caséine κ lors de la fabrication de fromages. Ce n’est pas une protéine globulaire : elle est donc plus stable face aux traitements thermiques. Elle a un masse molaire de 8 000 g/mol et est reconnue pour sa richesse en résidus d’acides aminés alcools, sérine et thréonine (Euston, Al-Bakkush, & Campbell, 2009).

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion La sérum albumine ou BSA (5%) a un masse molaire de 64 000 g/mol (Kuhn & Cunha, 2012). Elle a une structure ellipsoïdale avec, à sa surface, des poches hydrophobes permettant de fixer des ligands hydrophobes de masse molaire comprise entre 100 et 600 g/mol tels que des résidus d’acides gras à longue chaîne (acide palmitique) (Gaucheron, 2004). La BSA peut également interagir avec des ions tels que le cuivre, le nickel, le magnésium et le calcium (KAMagnésium < KACalcium = 1,5.103 M-1 < KACuivre) (Gaucheron, 2004). Sa structure flexible lui permet de changer facilement de conformation. Son pHi est de 4,7 (Gaucheron, 2004).

La lactoferrine (5%) : glycoprotéine de 88 000 g/mol, c’est également une métalloprotéine puisque sa chaîne polypeptidique est bilobée ; chaque lobe pouvant fixer un atome de fer oxydé (nombre d’oxydation : + 3 ; fer ferrique). La présence de bicarbonate est indispensable pour la bonne fixation du fer. Ce complexe protéine-fer est stable pour des pH compris entre 3 et 7. Son pHi est en effet situé autour de 8,4-9,0. A pH < 7, cette protéine est donc chargée positivement.

Les immunoglobulines (5%), qui sont des protéines de masse molaire élevé (supérieur à 96 000g/mol), contenant des anticorps (principalement IgG).

Les protéoses-peptones désignent les peptides libérés lors de l’hydrolyse de la β-caséine durant la production de fromage. Ils sont au nombre de quatre : Le PP5, le plus long, de masse molaire 14 300 g/mol ; le PP8-1 à 9 900 g/mol et enfin le PP8-r à 4 000 g/mol. A cela s’ajoute le PP3, glycoprotéine phosphorylée de 28 000 g/mol, capable de fixer le calcium.

d) Facteurs affectant la structure et les propriétés des protéines : le rôle du pH

Au cours des différents traitements, les protéines risquent de se dénaturer. Cette dénaturation peut se limiter à des changements conformationnels sans perte de solubilité, ou aller beaucoup plus loin, c'est-à-dire, par exemple, jusqu’à l’agrégation irréversible ou la gélification du système protéique. Dans tous les cas, leurs propriétés fonctionnelles s’en trouvent modifiées. Il est donc important de connaître les paramètres à l’origine de ces modifications fonctionnelles ainsi que leurs modes d’action.

Par principe, une protéine est encadrée par une double couche d’hydratation et de contre ions (ions de charges inverses à celles de la surface de la protéine considérée).

Lorsque l’on approche du pHi, la taille des particules augmente, puisqu’à cette valeur les protéines sont moins chargées et peuvent alors engendrer des agrégats via la diminution des forces électrostatiques. En effet, ces dernières sont très sensibles aux variations de pH et de force ionique (Weil & Bonnet, 2001). L’agrégation apporte certaines propriétés (notamment une augmentation de la viscosité) qui peuvent être recherchées, selon le type de produit fabriqué. Ce n’est donc pas un phénomène à éviter mais à maîtriser (Demetriades & McClements, 2000).

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion e) Facteurs affectant la structure et les propriétés des protéines : les traitements

thermiques

L’augmentation de la température d’une solution de protéines entraîne d’abord la rupture des liaisons hydrogènes (favorisées en présence d’eau), puis ioniques, et peut même, quelques fois, détruire les ponts disulfures ou provoquer un échange de ponts disulfure. En effet, le fait de chauffer entraîne une augmentation des SH disponibles (Hongsprabhas & Barbut, 1997b).

Cette destruction des ponts disulfures expose les groupes réactifs et/ou ouvre les structures, qui peuvent alors se dépolymériser. Cependant, elle est généralement à l’origine de la création de nouveaux ponts disulfures inter ou intramoléculaires par échanges irréversibles non spécifiques (Roth, 2001). Pour la BSA et la β-lactoglobuline, la polycondensation qui en résulte engendre une diminution de la solubilité.

Dans certains cas, la chaleur peut être à l’origine de l’augmentation de la viscosité entraînant par la suite une gélification des protéines. Le traitement thermique augmente les interactions hydrophobes propices aux interactions intermoléculaires à l’origine de l’agrégation. Ces effets vont être dépendants du type de protéine considéré, du pH, de la force ionique et de la nature des sels présents. Pour une protéine donnée, le gel formé dépend principalement des agrégats formés durant l’étape de chauffage.

La β-lactoglobuline a été très étudiée pour ses capacités d’agrégation et de gélification sous certaines conditions (Ako et al., 2010; Bryant & McClements, 2000; Donato, Kolodziejcyk, & Rouvet, 2011; Donato, 2004; Ju & Kilara, 1998; Nicolai et al., 2011). Cependant, d’après Nicolai et al. (2011), la vitesse d’agrégation est très faible à température ambiante ou à pH 5,5 jusqu’à 50 °C. De plus, le temps de chauffage nécessaire pour former ces agrégats doit être supérieur à 5 min.

Une électrophorèse déterminant l’état des protéines permet de montrer que, quelque soit le chauffage effectué, la taille des protéines n’est pas intacte ; elles sont donc, au moins en partie, dénaturées. Plus la température de chauffage augmente, plus la bande correspondant aux monomères diminue ce qui indique qu’à forte température il y a polymérisation.

D’après Singh & Ye, (2009), les protéines sériques sont instables à l’élévation de la température.

La dénaturation thermique de la β-lactoglobuline, à pH 6,8, a lieu à partir de 15 secondes, à 76 °C. L’α-lactalbumine se dénature, si, à pH 6,8, la température dépasse les 63 °C. Cependant, elle est dotée d’une forte capacité à la renaturation (capacité à revenir à sa forme initiale après que l’agent perturbant ait été enlevé). Pour cette raison, la dénaturation thermique irréversible de cette protéine n’a lieu que si elle est soumise à 100°C pour une durée minimum de 5 min.

Voici les paramètres de traitement thermique à appliquer afin d’engendrer la dénaturation des protéines sériques (Lin et al., 2010) :

- l’immunoglobuline est la plus sensible : dénaturation à 74 °C dès 15 s, - suivie de la BSA : dénaturation à 84 °C dès 15 s,

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion - enfin, à sensibilité moindre l’α-lactalbumine : dénaturation à 100 °C dès 5 min.

Lors du chauffage, l’α-lactalbumine s’agrège moins vite que la β-lactoglobuline, du fait de sa faible teneur en groupes thiol libres (Euston et al., 2009).

Si une solution de protéines sériques est chauffée durant 5 min à 80 °C, plus de 55% des protéines seront dénaturées. La majorité de ces protéines forment alors des agrégats (Surel et al., 2013). Plus la température est supérieure à la température de dénaturation, plus la dénaturation est rapide et irréversible.

La dénaturation et les traitements thermiques ont un impact important sur les propriétés interfaciales et foisonnantes des protéines, puisqu’ils ont un rôle sur la flexibilité et l’hydrophobie de surface des protéines. Selon la protéine et l’étude considérées, les protéines traitées thermiquement, se dénaturent et :

- deviennent plus flexibles et peuvent mieux enfouir leurs zones hydrophobes en leur cœur ou - deviennent moins flexibles et perdent en capacité d’adsorption.

Ces variations de conformation améliorent les propriétés moussantes des solutions protéiques et impactent le ratio protéines non-agrégées/agrégats.

La dénaturation des protéines solubles est un bon indicateur de l’intensité du traitement thermique subit (Schuck, 2002).

f) Facteurs affectant la solubilité des protéines dans l’eau

La solubilité des protéines dans l’eau dépend de l’importance relative entre les interactions inter-protéiques (non favorables à la solubilité) et les interactions entre molécules protéiques et molécules d’eau.

Si le nombre résidus d’acides aminés hydrophobes d’une protéine dépasse les 30%, alors ils ne pourront pas tous être enfouis au cœur de la structure et certains se retrouveront en surface. La solubilité de la protéine sera donc diminuée si la composante attractive apportée par les résidus hydrophobes en surface est supérieure à la composante répulsive due à l’hydratation et aux charges de surface.

La solubilité est fonction de la force ionique, du pH, de la température, et de la constante diélectrique. Au-delà de 40 °C, la solubilité n’augmente plus, puisque la dénaturation des protéines commence avec la sortie du cœur hydrophobe.

Une modification de la constante diélectrique du solvant (80 pour l’eau, 33 pour l’éthanol, 1,84 pour le pentane) diminue l’hydratation des protéines et favorise les changements de conformation par affaiblissement des associations hydrophobes (éléments stabilisateurs des protéines).

Plus le pH est proche du pHi de la protéine, plus sa solubilité diminue. En effet, la charge de surface est réduite au pHi, ce qui peut entraîner des modifications de conformation et donc de solubilité.

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion Pour de faibles concentrations de sels (de 0,5 à 1 M), les ions réagissent avec les charges des protéines en diminuant les interactions électrostatiques attractives. Ils ont alors une sphère de solvatation plus faible, permettant d’avoir plus d’eau solvante disponible pour la solubilité des protéines.

En présence de sels, les interactions polaires ionisées sont modifiées. Par exemple, en présence de sels monovalents les interactions inter ou intramoléculaires répulsives telles que (COO----+NH3) attractives et (COO----COO) ou (NH3+---+NH3) répulsives, vont diminuer fortement.

Ce changement entrainera une augmentation de la solubilisation dans l’eau. Ce phénomène est appelé « salting-in ».

En présence de calcium, il y aura formation de ponts salins engendrant, selon le cas considéré, une diminution de la solubilisation ou la formation d’un réseau.

A plus forte valeur de force ionique, les charges de surface sont crantées et la solubilité diminue. Cela est dû à la compétition entre les groupements polaires des protéines et les ions salins pour les molécules d’eau. A forte concentration de sel, la sphère de solvatation des protéines diminue, ce qui permet aux interactions protéines-protéines d’avoir lieu et entraîne alors une agrégation, voire une précipitation des protéines. Ce phénomène est appelé « salting-out ».

g) Facteurs affectant la structure et les propriétés des protéines : les minéraux

L’affinité de la protéine pour les minéraux diminue si le pH diminue ou si la force ionique augmente. La réactivité des groupes sulfhydriles augmente avec la teneur en calcium. Cela peut être à l’origine de la création de ponts intramoléculaires entre les groupes chargés de la protéine et le calcium. De plus, la fixation du calcium sur la β-lactoglobuline entraîne une modification de conformation de la protéine. Ces interactions augmentent également l’hydrophobicité de la protéine, ainsi que son nombre de ponts disulfures.

L’ajout de minéraux dans une solution de protéines sériques venant de subir un traitement thermique entraîne la formation d’un gel (Ako et al., 2010; Donato et al., 2011).

La gélification est un processus en deux étapes : la dénaturation partielle des protéines, puis leur association ou agrégation (Kinsella & Whitehead, 1989). La gélification ne se fait pas lors du chauffage, mais lors du refroidissement. La température de gélification correspond à la température de refroidissement appliquée à la solution, qui entraine une gélification, plus ou moins importante en fonction de sa valeur et des conditions de chauffage.

Les minéraux les plus étudiés pour mettre en évidence ce phénomène sont le NaCl, le KCl, et le CaCl2 (Bryant & McClements, 2000; Hongsprabhas & Barbut, 1997b; Ju & Kilara, 1998; Keowmaneechai & McClements, 2002; Nicolai et al., 2011). En effet, l’ajout de minéraux réduit les interactions électrostatiques répulsives entre les protéines limitant ainsi la barrière de charge cinétique évitant le rapprochement des molécules.

Le calcium, de part sa bivalence, permet de diminuer plus rapidement les interactions électrostatiques. De plus, il est capable de former des ponts calciques interprotéines si ces dernières sont chargées négativement

Etat de l’arte 1" Résultats et discussion (Bryant & McClements, 2000), c'est-à-dire pour pH > pHi. Il permet donc la création d’un gel même à faible dose.

h) Facteurs affectant la structure et les propriétés des protéines : les agents dénaturants La présence d’urée déplisse les protéines sériques en modifiant les interactions protéines-protéines au profit des interactions protéines-solvant, en changeant les interactions hydrophobes (Phillips, Whitehead, & Kinsella, 1994). L’alcool, quant à lui, favorise les liaisons électrostatiques des protéines et diminue leurs interactions hydrophobes : la formation d’hélices α est favorisée.