Matériels et méthodes
3.1. Caractérisation du lactosérum
3.1.1. Produits analysés
Les analyses sont faites sur :
- les citernes de lactosérums de différentes provenances, - les tanks initiaux de sérums de 90 000 l
- les tanks initiaux de sérums de 90 000 l, additionnés de TPP, - les sérums après concentration et pasteurisation.
Pour ces derniers, la viscosité empêche une analyse du produit tel quel. Ils sont donc dilué afin d’atteindre un extrait sec proche de celui du sérum initial, excepté pour l’analyse rhéologique. Pour obtenir 100 g d’échantillon, 60 g de sérum concentré sont dilués avec de l’eau qsp 100 g. De plus, le sérum étant conservé à 6 °C avant analyse, le lactose qu’il contient cristallise. Pour avoir un produit homogène chaque lactosérum est chauffé à 68-70 °C avant analyse.
3.1.2. Détermination de la matière sèche
Mode opératoire
Une capsule contenant environ 20 g de sable et la baguette en verre sont placées dans l’étuve pendant au moins une heure, puis transférées immédiatement dans le dessiccateur. Une fois les capsules à température ambiante (20 °C / 25 °C), elles sont pesées avec la baguette, à 0,1 mg près.
Une masse d’échantillon équivalente à une matière sèche dégraissée de 0,300 à 0,500 g est pesée dans la capsule, complétée par 3 ml d’eau. Le mélange est homogénéisé avec le sable à l’aide de la baguette, puis étalé uniformément sur le fond de la capsule.
La capsule est placée pendant 30 minutes sur un bain d’eau bouillante (102 °C) et son contenu est remué fréquemment pendant les premiers stades du séchage, de manière à bien aérer le mélange et le rendre friable. Puis elle est placée à l’étuve pendant 4 heures.
A sa sortie, elle est mise immédiatement dans le dessiccateur afin de la laisser refroidir à température ambiante.
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion La matière sèche, exprimée en grammes par kilogramme, est égale à :
𝐸𝑆 = 𝑚2 − 𝑚0
𝑚1 − 𝑚0× 1000
avec :
m0 est la masse de la capsule avec la baguette, en grammes (g) m1 est la masse de la capsule et de la prise d’essai, en g m2 est la masse de la capsule et de la prise d’essai sèche, en g ES : l’extrait sec de l’échantillon en g/kg
Cette méthode est une méthode normée (NF-V-04-295), avec un intervalle de confiance de 2%. Cette analyse est faite au laboratoire qualité de Bonilait Protéines.
3.1.3. Caractérisation des protéines
a) Dosage de la matière azotée par la méthode de Kjeldahl Mode opératoire
La matière azotée totale (MAT ; azote total x 6,38, le coefficient utilisé pour les produits laitiers) contenue dans les sérums est déterminée par la méthode de Kjeldahl. Cependant, pour déterminer la teneur en protéines, une analyse à la mesure de la teneur en azote non protéique (NPN ; azote non protéique x 6,38) est également réalisée.
Cette dernière s’obtient par le dosage de l’azote total du surnageant, obtenu après précipitation de la totalité des protéines, en présence d’acide trichloracétique à 12%. La quantité de protéines se calcule ensuite de la façon suivante :
PROT = MAT – NPN
MAT : matière azotée totale en g/kg NPN : matière azotée non protéique en g/kg PROT : protéines vraies en g/kg
Un pourcentage d’azote non protéique contenu dans la MAT peut également être calculé :
%𝑁𝑃𝑁 = 100 ×𝑁𝑃𝑁
𝑀𝐴𝑇
Il permet de définir la part de la MAT n’ayant pas de propriétés émulsifiantes.
La méthode de Kjeldahl (Kjeldahl, 1883) est une méthode normée, son écart-type est donc connu : 0,038% (Norme NF-V04-221-4 ; ISO 8968-3).
Les résultats sont exprimés en g de MAT et en g de protéines pour 100 g d’ES sérum, et en g de NPN pour 100 g de MAT.
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Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion Cette analyse est faite au laboratoire qualité de Bonilait Protéines et en laboratoire extérieur.
Pour chaque produit, 3 échantillons sont analysés, puis la moyenne est faite. Si le coefficient de variation est supérieur à 3%, la valeur incohérente est éliminée et l’analyse des résultats se fait sur la moyenne des deux valeurs restantes.
b) Détermination de l’état des protéines par électrophorèse SDS-PAGE Principe
Le but est de quantifier et qualifier les différentes protéines contenues dans les lactosérums.
Cette analyse a été faite à l’Inserm MINT1066 ainsi qu’à l’unité de recherche Animal et Fonctionnalités des Produits Animaux (UR AFPA) de l’Université de Lorraine, par M. Girardet.
Mode opératoire
Le protocole est issu du travail de Martinet et al. (2005). Deux échantillons de chaque produit sont analysés, sur deux gels différents.
La formulation des échantillons
Les produits sont dilués dans le but d’avoir 250 µl d’échantillons concentrés à 1µg de protéine/1 µl.
Pour le lactosérum, 178,6 µL de sérum et (250 - 178,6) = 71,4 µL d’eau distillée sont mélangés, en considérant une concentration protéique de 7 g.l-1 dans le produit.
Le même calcul est effectué pour les autres types de produits : - pour le lait : 39,1 µL de lait et 210,9 µL d’eau distillée
- pour les émulsions reconstituées : 250 µL de l’émulsion reconstituée à 10%. A cela est ajouté, par échantillon :
- 250 µl de Tris-HCl (0,125M),
- 50 µl de DTT (permet de réduire les ponts disulfures) et
- 200 µl de SDS 10% (charge toutes les protéines négativement). Les échantillons sont chauffés à 100 °C durant 5 à 10min, puis sont ajoutés :
- 500 µl de glycérol 20%
- 1 goutte de solution de bleu de Bromophénol (250 mg dans 100 ml) L’étape de migration
Un gel de polyacrylamide à 10% est coulé entre deux plaques de verre.
Les peignes sont enlevés pour laisser apparaître les puits dans lesquels seront mis les échantillons. Les plaques de verre sont retirées du dispositif de coulage et les gels sont installés dans le dispositif de migration (système Mini-Protéane 3 ; Bio-Rad), dans lequel est ajouté le tampon de migration :
- 28,8 g glycine, - 6 g de Tris base, - 2 g de SDS, - eau qsp 2 l.
Les échantillons ainsi que le marqueur de masse molaire sont déposés dans les puits, à raison d’un échantillon de 20 µL par puits, et de deux puits pour chaque échantillon.
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion La migration se fait avec la mise en route du générateur à 100 V et 450 mA.
La révélation
Une fois que le front de migration est sorti du gel (environ 2h30 de migration), la migration est stoppée. Les gels sont récupérés et déposés dans un bain de fixation qui est une solution aqueuse d’acide trichloracétique (TCA) à 120 g/l.
Le gel reste dans cette solution 1h, puis est transféré dans un bain de coloration pour une même durée. La solution de coloration est composée de :
- 2,5 g de bleu de Coomassie R250, - 245 ml de méthanol,
- 455 ml d’eau distillée, - 90 ml d’acide acétique pur.
Il reste alors une nuit dans le bain de décoloration composé de : - 455 ml d’éthanol,
- 455 ml d’eau distillée, - 90 ml d’acide acétique pur.
Le gel est enfin rincé trois fois à l’eau distillée, et conservé dans de l’eau distillée.
Concernant les analyses menées à l’UR AFPA, les protocoles utilisés sont ceux décrits par Girardet et al. (2004), adapté de Laemmli & Favre (1973) et Paquet, Nejjar, & Linden (1988).
3.1.4. Caractérisation des minéraux
a) Détermination de la teneur en matière minérale par analyse des cendres
Après avoir séché la capsule au moins une heure dans une étuve à 103 °C, elle est mise dans un dessiccateur jusqu'à son complet refroidissement. La capsule est ensuite tarée avant l’ajout de 2 g de produit. Elle est alors laissée au four à 550 °C ± 20 °C pendant 5 heures. A sa sortie, elle est de nouveau mise dans un dessiccateur et recouverte d'un couvercle en inox. Lorsque la capsule est refroidie à température ambiante, elle est pesée sans le couvercle.
L’huile ne contenant pas de matière minérale, cette analyse peut être faite sur le sérum ou sur le produit fini, à partir du moment où la teneur est rapportée à la teneur en lactosérum contenu dans la poudre.
Cette méthode suit la norme NF-V04-151. L’intervalle de confiance est de 0,40 g. Cette analyse est faite par le laboratoire qualité de Bonilait Protéines.
b) Détermination de la composition minérale
Cette analyse est réalisée par un laboratoire extérieur (Labco) avec la méthode de spectro d’absorption atomique.
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion c) Détermination de la teneur en calcium et magnésium par dosage colorimétrique
Principe et appareillage utilisé
Le dosage du calcium est un dosage colorimétrique par complexation. Il est basé sur la formation de complexes très stables entre les ions Mg2+, Ca2+ et l’EDTA, incolores. Un indicateur coloré de fin de réaction est ajouté : le Noir Eriochrome T (NET), un agent complexant de couleur bleu lorsqu’il est libre en solution. En présence d’ions magnésium le NET donne un complexe rouge-violet Mg-NET2+.
Le NET est introduit dans la solution contenant les ions à doser. Il forme un complexe Mg-NET2+ rouge-violet.
L’EDTA présent dans la burette est versé goutte à goutte dans la solution. Il réagit en premier lieu avec les ions calcium, pour lesquels il a le plus d’affinité, les complexant. Une fois tous les ions calcium complexé, l’EDTA, que l’on continu d’ajouter, réagira avec les ions magnésium.
Le complexe Mg-NET2+est détruit puisque les ions Mg2+ ont plus d’affinité pour l’EDTA. Le NET se retrouve alors sous forme libre, et la solution passe du rose au bleu. C’est un dosage de deux ions : le calcium et le magnésium. Ce dosage ne peut avoir lieu que si le mélange contient des ions magnésium puisque ce sont ces derniers qui interagissent avec l’indicateur coloré.
Figure 20 : Schéma du montage utilisé pour le dosage des ions calcium et magnésium.
Cette analyse a été faite au laboratoire R&D de Bonilait Protéines.
Mode opératoire
Dans un bécher de 75 ml muni d’un barreau aimanté, on ajoute 2 mL de lactosérum et on complète avec de l’eau distillée, qsp 50 ml. L’EDTA étant actif à pH 10, la solution aqueuse est tamponnée avec 3 ml de solution d’ammoniac (34 g de chlorure d’ammonium, 285 mL d’ammoniac 25%, 200 g de tartrate double sodium potassium, qsp 1 l d’eau distillée). Six gouttes de NET (0,2 g NET dans 50 mL d’éthanol pur) sont ensuite ajoutées.
Cette solution rose est ensuite chauffée et agitée, puis dosée par une solution de sel disodique d’EDTA (complexon III) à 10-2 M.
Le dosage est réalisé à 40 °C afin d’accélérer la réaction. Lorsque la solution à doser passe de la couleur rose-violacée au bleu, alors l’équivalence est atteinte : tous les ions calcium et magnésium ont été complexés. Nous obtenons un volume équivalent (volume versé d’EDTA). Grâce au bilan de matière, nous pouvons alors déterminer la concentration de calcium et magnésium.
[Mg2++Ca2+] x V(échantillon) = [EDTA] x V(EDTA)
[Mg2++Ca2+] = [EDTA] x V(EDTA) / V(échantillon)
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Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion Pour connaître la concentration de calcium, il faut faire une analyse indirecte, en dosant le magnésium.
Dans un bécher de 75 ml muni d’un barreau aimanté, 4 mL de lactosérum sont ajoutés et complétés avec de l’eau distillée, qsp 100 ml. Ce mélange est additionné de 12,5 ml d’une solution d’oxalate d’ammonium (50 g/l). Après agitation et repos durant 30 min, la solution est filtrée sur papier plissé. Le filtrat est dosé de la même façon que précédemment : en présence de NET par une solution de sel disodique d’EDTA.
Cela permet d’obtenir la concentration en magnésium du milieu : [Mg2+] = [EDTA] x V(EDTA) / V(échantillon)
Et d’en déduire la concentration de calcium : [Mg2++Ca2+] - [Mg2+] = [Ca2+]
Pour chaque produit, 3 échantillons sont analysés, puis la moyenne est faite. Si le coefficient de variation est supérieur à 3%, la valeur incohérente est éliminée et l’analyse des résultats se fait sur la moyenne des deux valeurs restantes.
Les résultats sont exprimés en g de calcium pour 100 g d’ES sérum.
d) Détermination de la conductivité Principe
La conductivité est une grandeur physique qui permet de quantifier l’aptitude d’une solution à conduire le courant. Elle est liée à la quantité d’ions présents dans le milieu, puisque ce sont ces éléments qui conduisent le courant électrique. C’est une mesure effectuée entre deux électrodes : une borne + et une borne -. Les cations circulent vers la borne – et les anions vers la borne +.
La conductivité dépend de la nature et de la concentration des ions en présence ainsi que de la température. La comparaison des résultats n’est possible que si les analyses sont faites à même température.
De même, la valeur de conductimétrie est pondérée par l’extrait sec, puisqu’elle est proportionnelle à la concentration d’ions présents et donc à la teneur en matière sèche.
Cette analyse a été faite au laboratoire R&D de Bonilait Protéines.
Mode opératoire
La mesure de conductimétrie est effectuée sur 100 g de lactosérum agités à l’aide d’un barreau aimanté. Les résultats sont exprimés en valeur de conductivité en mS/cm.
3.1.5. Caractérisation rhéologique
Principe et appareil utilisé
Les propriétés d’écoulement ont été caractérisées à l’aide d’un rhéomètre MCR 301 (Anton Paar). Cet appareil permet de mesurer la viscosité à contrainte ou à vitesse de cisaillement imposée. La température est contrôlée : isotherme ou suivant des variations imposées. L’utilisation d’une géométrie de type cylindres (15)
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion coaxiaux permet une adaptation à la viscosité du milieu : double entrefer pour les lactosérums (Schröder et al., 2012).
Pour chaque produit, 3 échantillons sont analysés, puis la moyenne est faite. Le coefficient de variation est inférieur à 5%.
Cette analyse a été réalisée au sein de l’UMR Ingénierie Procédés Aliments (Massy).
Mode opératoire
Les courbes d’écoulement des lactosérums sont obtenues à 60 °C (température identique à celle de production) par des mesures réalisées par palier à vitesse de cisaillement variable, suivant la rampe suivante : 750-100-750 s-1.