Matériels et méthodes
3.3. Caractérisation des émulsions liquides
3.3.8. Caractérisation de l’interface
a) Mesure de la charge de surface Principe et appareil utilisé
Le potentiel zeta est la mesure de la magnitude de répulsion ou d’attraction entre les particules. Les particules en suspension possèdent une charge de surface qui modifie la distribution des ions.
Le potentiel zeta est le potentiel au niveau de la limite de la couche et du reste de la solution. A cet endroit, la charge est très sensible à la concentration de particules ainsi qu’aux types d’ions présents dans la solution (double couche ionique autour de l’interface).
Figure 26 : Schéma explicatif du principe de fonctionnement d’un zetamètre (malvern.com).
Ce potentiel permet de caractériser les interactions interparticulaires. En effet, les particules de même potentiel zeta se repousseront l’une l’autre.
On considère avoir un haut potentiel zeta lorsque sa valeur est supérieure à |30| mV (Delgado, González-Caballero, Hunter, Koopal, & Lyklema, 2007; Hunter, 2001). Si cette valeur dépasse les |50| mV alors la charge des particules permet leur stabilisation dans le milieu considéré (Hunter, 2001; Xu, 2008).
Un Zetasizer nano Malvern (Orsay, France) a été utilisé pour mesurer le potentiel zeta, par l’application d’un champ électrique au travers de l’émulsion.
Les particules possédant un potentiel zeta positif vont migrer vers l’électrode ayant une charge négative (et inversement), à une vitesse proportionnelle à la valeur de leur charge. Cette vitesse est mesurée par une technique de laser Doppler anémométrique.
Le décalage de fréquence d’un laser incident causé par ce mouvement de particules, est mesuré et converti, en faisant intervenir un calcul avec la viscosité du dispersant et le modèle de Smoluchowski (dans notre cas), en potentiel zeta.
L’appareil étant très sensible, une dilution au millième et deux millièmes pour nos émulsions est faite. En effet, l’analyse par la technique de Doppler ne peut évaluer des échantillons troubles ni trop concentrés. Bien que la modification de la concentration de particules permette d’avoir une valeur stable de potentiel zéta, cette valeur n’est pas représentative de ce qu’il y a dans le mélange lorsque ce dernier n’est pas dilué (Xu, 2008).
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion Cette analyse a été menée à l’Inserm MINT1066.
Mode opératoire
La mesure est validée seulement s’il n’y a qu’un seul pic et que l’appareil indique : « good », sur deux dilutions successives.
Si la valeur change entre les deux dilutions, avec un coefficient de variation supérieur à 5%, l’analyse ne peut être validée.
Figure 27 : Exemple de résultats obtenus lors de l’analyse d’émulsion à l’aide d’un zetamètre.
b) Détermination des protéines adsorbées par centrifugation et dosage de Lowry Principe : dosage de Lowry
Pour déterminer la teneur en protéines adsorbées, la méthode de Lowry est utilisée. Cette méthode a été développée par Lowry et al (1951) qui ont combiné une réaction au biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, réagit avec les résidus de tyrosine et de tryptophane, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute à celle du biuret.
La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa principale qualité. Elle peut atteindre 5-10 µg. La zone de linéarité de la réaction est cependant étroite. Il faut que la concentration des échantillons se trouve dans cette gamme, à savoir entre 0 et 0,5 g.l-1 de protéines.
L’inconvénient de cette méthode est sa grande sensibilité à de très nombreuses substances interférentes: certains peptides et acides aminés, le saccharose, le glycérol, l'EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique),…
Cette analyse a été faite au laboratoire R&D de Bonilait Protéines.
Mode opératoire
En centrifugeant les émulsions il est possible de séparer les protéines adsorbées, restant dans la phase grasse, des protéines non adsorbées (PNA) restant dans la phase aqueuse. La méthode de séparation et de dosage est la suivante : des tubes à centrifugation contenant 25 g d’ER sont centrifugés à 2 400 g durant 20 min.
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion La phase aqueuse est alors prélevée et quantifiée, puis centrifugée de nouveau avec le même barème afin de retirer les derniers grammes de matière grasse.
Figure 28 : Schéma du mode opératoire permettant la récupération des protéines non adsorbées d’une émulsion liquide.
Les protéines non adsorbées contenues dans la phase aqueuse vont alors être dosées par la méthode de Lowry, après une dilution au dixième.
Pour cela, 5 ml de réactif cuivrique alcalin (100 ml de carbonate de sodium à 2% dans de la soude à 0,1 M (molaire) additionné de 1 ml de sulfate de cuivre à 1% et de tartrate double de sodium et potassium à 2%) sont ajoutés à 0,5 ml d’échantillon. Ce réactif permet de déterminer le pouvoir biurétogène des protéines. Après 10 min d’attente, 0,5 ml du second réactif ; le phosphotungstomolybdique (réactif de Folin-Cioccalteu) sont ajoutés. Le mélange se colore alors en bleu, plus ou moins foncé, en fonction de la teneur en protéines. L’absorbance est ensuite déterminée par spectrométrie, à 720 nm, après 30 minutes.
La gamme étalon nécessaire à la détermination de la concentration de protéines de nos échantillons est faite à partir d’un lactosérum en poudre, réhydraté. Cela permet d’éviter toute interférence avec les composés présents dans nos émulsions, tels que le lactose.
La teneur en protéines vraies de ce lactosérum étalon, est dosée selon la méthode de Kjeldahl, expliquée ci-dessus. La gamme étalon est obtenue en analysant ce sérum, avec le dosage de Lowry, à différentes concentrations : 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 et 0,5 g.l-1 de protéines.
Une gamme étalon est alors obtenue, telle que présentée ci-dessous :
Figure 29 : Exemple de courbe étalon obtenue avec différentes dilutions de lactosérums doux en poudre, à teneur en protéines connues. y = 1,3593x R² = 0,998 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 D O à 720n m Concentration en protéines g/l
Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion Pour quantifier les protéines totales, 15 ml de SDS sont ajoutés à chaque tube à centrifugation contenant 25 g d’ER.
Après agitation et 30 minutes d’attente, les tubes sont centrifugés à 10 000 g durant 30 min. La phase aqueuse est alors prélevée et quantifiée, puis centrifugée de nouveau à 10 000 g durant 20 min afin de retirer les derniers grammes de matière grasse.
Un barème de centrifugation plus agressif permet de désorber les dernières PNA que le SDS aurait pu laisser.
Le SDS déplace les protéines de l’interface, ainsi toutes les protéines se retrouveront dans la phase aqueuse.
Figure 30 : Schéma du mode opératoire permettant la récupération des protéines totales d’une émulsion liquide.
Le dosage s’effectue de la même façon que pour les PNA.
Mesure des protéines non adsorbées
𝑃𝑁𝐴25 = 𝐷𝑂 × 10 × 𝑉𝜑𝑎𝑞
𝑝 × 1000
𝐸𝑆𝑠é𝑟𝑢𝑚 = 𝑇𝑠é𝑟𝑢𝑚 × 𝐸𝑆 × 25
1000
𝑃𝑁𝐴 = 𝑃𝑁𝐴25
𝐸𝑆𝑠é𝑟𝑢𝑚=
1000 × 𝐷𝑂 × 𝑉𝜑𝑎𝑞
𝑝 × 𝑇𝑠é𝑟𝑢𝑚 × 𝐸𝑆 × 25
PNA25 : protéines non adsorbées (g/25g d’émulsion) DO : densité optique de l’échantillon à 720 nm
Vφaq : volume de phase aqueuse mesuré après la première centrifugation (en mL) P : pente de l’équation de la courbe étalon
ESsérum : matière sèche de sérum (g/25 g d’émulsion)
Tsérum : rapport de sérum présent dans l’ES de l’ER (par exemple 0,45 pour une poudre à 55% de MG) ES : extrait sec de l’émulsion (g/kg)
PNA : protéines non adsorbées (g/100g d’ES sérum)
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Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion Mesure des protéines totales
𝑃𝑡𝑜𝑡25 = 𝐷𝑂 × 10 × 𝑉𝜌𝑎𝑞
𝑝 × 1000
𝐸𝑆𝑠é𝑟𝑢𝑚 = 𝑇𝑠é𝑟𝑢𝑚 × 𝐸𝑆 × 25
1000
𝑃𝑡𝑜𝑡 = 𝑃𝑡𝑜𝑡25
𝐸𝑆 𝑠é𝑟𝑢𝑚 =
1000 × 𝐷𝑂 × 𝑉𝜌𝑎𝑞
𝑝 × 𝑇𝑠é𝑟𝑢𝑚 × 𝐸𝑆 × 25
Ptot25 : protéines totales (g/25g d’émulsion) DO : densité optique de l’échantillon à 720nm
Vφaq : volume de phase aqueuse mesuré après la première centrifugation (en mL) ESsérum : matière sèche de sérum (g/25 g d’émulsion)
Tsérum : rapport de sérum présent dans l’ES de l’émulsion (par exemple 0,45 pour une poudre à 55% de MG) ES : extrait sec de l’émulsion (g/kg)
Ptot : protéines totales (g/100g d’ES sérum)
Mesure de la teneur en protéines adsorbées
%𝐹𝐴𝐷𝑆 = 𝑃𝑡𝑜𝑡 − 𝑃𝑁𝐴
𝑃𝑡𝑜𝑡 × 100
Pour chaque produit, 3 échantillons sont analysés, puis la moyenne est faite. Si le coefficient de variation est supérieur à 3%, la valeur incohérente est éliminée et l’analyse des résultats se fait sur la moyenne des deux valeurs restantes.
Les valeurs mesurées ici par la méthode de Lowry font l’objet d’une contre-analyse selon la méthode de Kjeldahl (MAT et NPN), effectuée par un laboratoire extérieur (NF-EN-ISO 8968-4), avec un intervalle de confiance de 0,05%.
Cette analyse a été faite au laboratoire R&D de Bonilait Protéines.
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Matériels et méthodese 1" Résultats et discussion c) Concentration surfacique en protéines
Grâce aux méthodes d’analyse précédentes : granulométrie laser et dosage de Lowry, la quantité de protéines adsorbées par m² de matière grasse est calculée.
En effet, la granulométrie laser effectuée sur les émulsions en présence de SDS nous donne le D[3,2] et donc la surface de matière grasse à couvrir avec la formule suivante :
𝑆 =6 × 𝑉
𝐷 =
6 × 𝑚
𝑑 × 𝐷
S : surface de matière grasse (m²/100g d’émulsion) V : volume de matière grasse (ml/100g d’émulsion) D : diamètre des globules gras indépendants = D[3,2] (µm) m : masse de matière grasse (g/100g d’émulsion)
d : densité de l’huile = 0,9 pour l’huile de palme
Cette valeur combinée au FADS nous permet d’avoir la concentration surfacique en protéines, comme suit :