Les facteurs spécifiques de transcription

Les facteurs spécifiques de transcription sont regroupés dans plusieurs familles en fonction de leur origine évolutive ainsi que de leur domaine de liaison à l’ADN. Ils sont en général composés de trois domaines principaux, soient le domaine de liaison à l’ADN, le domaine d’interaction et un domaine de transactivation. Le domaine d’interaction est très varié et peut constituer un domaine de liaison à un ligand, un domaine d’interaction protéine-protéine ou un domaine de phosphorylation ou autre modification post-traductionnelle. Les facteurs de transcription peuvent aussi interagir avec certaines autres protéines appelées coactivateurs ou corépresseurs, qui servent généralement à créer ou empêcher la formation d’un lien entre le facteur de transcription et les protéines associées à l’ARN polymérase II. Les facteurs de transcription peuvent aussi exercer leur action sans être directement liés à l’ADN, mais en reconnaissant et en interagissant avec d’autres facteurs de transcription eux liés à l’ADN. Les séquences d’ADN situées de façon proximales à la machinerie de transcription sont d’une importance capitale et déterminent fréquemment le profil de transcription des gènes en fonction du contexte cellulaire. En effet, un même gène peut être régulé de façon drastiquement différente en fonction de la disponibilité des facteurs qui peuvent s’associer à son promoteur. Par ailleurs, plusieurs facteurs de transcription peuvent agir ensemble afin de moduler de façon subtile leur propre capacité de transactivation.

Dans le cadre de cette dissertation, un bref résumé des familles les plus fréquentes de facteurs de transcription sera présenté, mais il convient de mentionner que cette présentation ne fait que survoler un monde particulièrement riche, dont toutes les subtilités ne nous sont pas encore connues.

1.3.2.1. La famille à région basique et séquence glissière de leucine, (basic-region leucine-zipper; bZIP)

La première classe de facteurs de transcription d’importance, en particulier dans la voie du calcium déclenchée par l’activation du récepteur de la LH, contient les récepteurs de la famille à région basique et séquence glissière de leucine, (basic-region leucine-zipper; bZIP). Dans cette famille on retrouve différentes protéines dont la fonction semble être régulée en partie par la PKA. On y compte les représentants de la famille AP-1, dont les plus connus et les plus importants dans la cellule de Leydig sont c-JUN et c-FOS (167- 169). Ces facteurs de transcription peuvent agir comme hétérodimères avec d’autres protéines de leur famille dont les protéines de la famille ATF (activating transcription factor) ainsi que de la famille MAF (V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog). L’expression et l’activité des facteurs c-JUN et c-FOS sont régulées de façon transcriptionnelle et post-traductionnelle, notamment par les facteurs de transcription de la famille STAT et par les kinases MAPK et JNK, respectivement (170, 171). Les différents dimères peuvent ensuite se lier de façon préférentielle à des éléments de réponse partageant le même demi-site AP- 1 : PMA/TPA response element : TGACTCA (TRE) et cAMP-responsive element : TGACGTCA (CRE) (167).

Dans le cadre de la régulation de la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig, le facteur de transcription c- JUN a été bien caractérisé, principalement pour ce qui est de la régulation de l’activité du promoteur des gènes Star et Nr4a1 où son effet est fortement activateur (153, 169). Inversement, le facteur de transcription c- FOS semble être moins important pour l’activité de ces mêmes promoteurs. Dans tous les cas, la transfection des membres c-JUN et c-FOS dans les cellules de Leydig MA-10 augmente leur capacité stéroïdogénique et ces derniers font partie des effecteurs rapidement induits lors d’une stimulation du récepteur de la LH (172). Ceci rend la régulation de ces deux facteurs de transcription un domaine de recherche intéressant pour mieux comprendre l’activation de la stéroïdogenèse, ainsi que les cibles potentielles pour son inhibition.

Une autre famille de facteurs de transcription ayant démontré son implication dans la régulation de la transcription de Nr4a1 est celle des CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBP). De cette famille de 6 membres (C/EBPα, β, γ, δ, ε et ζ), C/EBPβ est le plus important dans les cellules de Leydig. C/EBPβ interagit vraisemblablement de façon synergique avec la sous-unité p50 du facteur de transcription NF-κB sur le

promoteur de Nr4a1 et pourrait ainsi contribuer à la régulation de Nr4a1 lors d’une stimulation hormonale (173). La famille de protéine NF-κB est brièvement décrite à la section 1.3.2.2.

Les facteurs de transcription de la famille des musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologs (MAF) sont divisés en deux sous-familles que sont les grosses (c-MAF, MAFB, MAFA, S-MAF2, NRL, DMAF) et les petites (MAFK, MAFF, MAFG, MAFT, MAF-S) protéines MAF (174). Ces deux sous-familles vont différer au niveau de leur capacité à activer ou réprimer l’expression de leurs gènes cibles. Cette différence s’explique, au niveau structural, par l’absence du domaine de transactivation chez les membres de la sous-famille des petites MAFs. Il en résulte que ces protéines vont être capables de réprimer l’action de leur partenaire, avec lequel ils forment un hétérodimère. Ainsi, les petites MAFs peuvent contrôler la transcription de gènes sous le contrôle des grosses MAFs (175). Tel que mentionné précédemment, les protéines de la famille MAF font partie de la famille des bZIP et leur motif de reconnaissance MARE contient un élément de réponse TRE tandis que le motif de reconnaissance T-MARE contient un élément de réponse CRE (175-178).

Plusieurs autres types de facteurs de transcription existent dans les cellules, et leur discussion dépasse le cadre de cette dissertation. Il convient tout de même de parler de l’existence d’une classe particulière de facteurs de transcription que sont les récepteurs nucléaires. Ces molécules seront abordées dans la section 1.3.2.5

1.3.2.2. Le facteur de réponse au sérum (SRF)

Le facteur de réponse au serum (SRF) est un facteur de transcription appartenant à la famille des MADS (MCM1, Agamous, Deficiens, and SRF) (179). SRF est un effecteur impliqué dans de nombreux processus physiologiques, notamment comme gène de réponse rapide suite à une stimulation par les facteurs de croissance. SRF est d’ailleurs une protéine essentielle au développement embryonnaire et au maintien des cellules musculaires et des neurones (180). Il a été rapporté comme étant impliqué dans la régulation de l’expression notamment de Fos, Junb, Fosb, et Egr1 (NGFI-C) (181). D’intérêt dans le contexte de ce projet, EGR1 est une protéine nécessaire à l’expression du récepteur de la LHβ dans la glande pituitaire (182). Egr1, est un gène rapidement induit suite à un stimulus, d’où ses deux noms : Early Growth Response 1 et Nerve Growth Factor-Inducible protein C (183). Ceci n’est pas sans rappeler NR4A1, aussi connu sous le nom de NGFI-B. Par ailleurs, SRF agit comme cofacteur avec plusieurs autres facteurs de transcriptions, dont GATA4, connu pour son rôle clé dans la reproduction et la stéroïdogenèse (184, 185). L’analyse de la séquence promotrice de Nr4a1 IA a montré la présence d’une boîte CArG (CCTTGTATGG), élément de liaison du

facteur SRF, ne contenant qu’un mésappariement (souligné) située dans la région NIR-A, à -115 pb du site d’initiation de la transcription. Il est donc pertinent d’évaluer si la surexpression de SRF dans les cellules de Leydig MA-10 pourrait contribuer à activer le promoteur Nr4a1 IA.

1.3.2.3. La famille NF-κB

La famille NF-κB est une famille de facteurs de transcription constituée de cinq protéines : p65 (RelA), RelB, c- Rel, p105/p50 (NF-κB1) et p100/52 (NF-κB2) (186). Ces protéines sont généralement stockées au cytosol, liées à une protéine inhibitrice IκB (186). La phosphorylation de IκB en réponse à un stimulus est essentielle pour la transduction du signal (186). NF-κB est aussi régulé de façon post-traductionnelle (186). Une fois libéré, NF-κB peut transloquer au noyau, où il agira en dimère avec d’autres membres de sa famille. Les facteurs de transcription NF-κB peuvent former jusqu’à 15 dimères différents en fonction du contexte cellulaire (186). NF-κB reconnait des variations d’une séquence consensus GGGRNYYYCC (où R représente une purine, Y représente une pyrimidine et N représente n’importe quel nucléotide) (187). Ce site de reconnaissance dégénéré est requis, mais non suffisant pour la régulation génique par NF-κB. En effet, il est vraisemblable que des modifications de la chromatine soient nécessaires afin de permettre à NF-κB d’accéder à ses sites de liaisons (188). Dans les testicules des mammifères, la présence de p50 et p65 a été démontrée chez les cellules de Sertoli et il est spéculé qu’il soit impliqué la régulation de la spermatogenèse, vraisemblablement en réponse à une stimulation des cellules par la FSH (189). Dans les cellules de Leydig, la transfection transitoire simultanée du facteur de transcription pour la sous-unité p50 de NF-κB avec C/EBPβ cause une augmentation de l’activité du promoteur de Nr4a1 (173). Il ressort que seul l’un des deux sites de liaisons à l’ADN (celui de C/EBPβ ou celui de NF-κB) est nécessaire à l’action synergique des deux facteurs sur l’activité promotrice de Nr4a1 IA.

1.3.2.4. Les facteurs de transcription de la famille base hélice-boucle-hélice (basic helix- loop-helix; bHLH)

Les facteurs de transcription de la famille base hélice-boucle-hélice (basic helix-loop-helix; bHLH) font partie de la plus étendue famille de facteurs de transcription agissant en dimères (190). Leur nom est issu de leur structure, caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN amino-terminal constitué d’un domaine basique et de deux hélices α liés entre eux par une boucle et servant à faciliter l’interaction avec d’autres protéines afin de créer des homo- ou hétéro-dimères (190). Les facteurs de la famille bHLH reconnaissent spécifiquement une séquence nommée la boîte E, qui varie selon le facteur de transcription étudié (190). Dans le cadre de

cette dissertation, seuls les membres CLOCK et BMAL1 seront décrits, puisque leur rôle potentiel dans la régulation de l’activité promotrice de Nr4a1 a été évalué.

Les deux facteurs de transcription CLOCK et BMAL1 ont été décrits comme étant les maîtres de la régulation du cycle circadien (191). Ces facteurs vont notamment réguler la transcription des gènes de la famille Period et Cryptochrome, et de la famille des récepteurs nucléaires apparentés aux récepteurs à l’acide rétinoique (retinoic acid-related orphan nuclear receptors; Rev-erbα et Rorα) (192). C’est avec ces partenaires qu’une

boucle de rétroaction d’une durée approximative de 24 heures est établie et constitue la base de l’horloge moléculaire du rythme circadien (192).

Les facteurs CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput) et BMAL1 (brain-muscle Arnt-like protein 1) remplissent leur rôle dans le cycle circadien à différents niveaux. Ils agissent non seulement directement comme facteurs de transcription, mais aussi au niveau génomique par la modification de l’organisation de la chromatine (191). En effet, CLOCK possède la capacité d’agir en tant qu’histone acétyle-transférase. Le couple CLOCK : BMAL1 peut entres autres promouvoir la libération de nucléosomes, rendant ainsi accessible ses propres sites de liaison à l’ADN (191). Par le fait même, le couple CLOCK : BMAL1 coordonne l’activité de plusieurs autres facteurs de transcription qui dépendent de changements dans l’organisation de la chromatine pour pouvoir accéder à leurs séquences régulatrices dans les promoteurs de leurs gènes cibles (191). Le dimère CLOCK : BMAL1 a aussi la capacité d’interagir avec certains coactivateurs tel CBP (CREB-binding protein) et p300 (193) afin d’en moduler l’effet. CBP et p300 sont bien connus pour agir en tant que coactivateurs associés notamment à CREB (193). Ces coactivateurs (et d’autres) peuvent donc agir comme lien entre le dimère CLOCK : BMAL et d’autres facteurs de transcription (193). Au niveau de leur rôle direct de régulateur transcriptionnel, le dimère CLOCK : BMAL1 reconnait spécifiquement les séquences ACGTG ou GCGTG (190). Certains des gènes clés qui sont régulés par le dimère CLOCK : BMAL1 sont C/EBPα (particulièrement important dans la régulation du métabolisme des lipides et du glucose), C/EBPβ (dans le contexte de la régulation de l’autophagie chez le poisson zèbre) et PGC1α/β (peroxisome proliferator-activated receptor gamma [PPARγ] coactivator-1 alpha/beta; un facteur interagissant avec le facteur MEF2 dans l’augmentation de l’expression de transporteurs du glucose dans le muscle squelettique), pour ne nommer que ces exemples (194-196). Puisque ces facteurs, parmi d’autres exemples non rapportés ici, sont connus pour être importants dans les cellules de Leydig, CLOCK et BMAL1 pourraient être des facteurs influents pour la régulation de la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig, notamment via la régulation de Nr4a1.

Dans le cadre des cellules de Leydig et de la stéroïdogenèse au sens large, il a été montré que BMAL1 régule directement l’activité promotrice de Star via la présence de trois boîtes E situées à -1500 pb, et -2000 pb du site d’initiation de la transcription (197). En revanche, dans la régulation de l’activité promotrice de Star, il semblerait que CLOCK n’agit pas comme partenaire avec BMAL1, tel que révélé par l’expression réduite du gène observée chez des souris modifiées génétiquement pour exprimer une forme dominante négative du gène CLOCK (197). Les évidences concernant la rythmicité de l’expression des gènes impliqués dans la stéroïdogenèse ne font pas consensus pour l’instant, bien que l’implication de BMAL1 dans la fertilité et la stéroïdogenèse semble établie (197). En effet, il n’est pas clair, au moins au niveau du gène Star, à quel point la régulation génique dans le testicule obéit à une rythmicité qui serait dictée par l’implication des membres de la machinerie de l’horloge moléculaire du cycle circadien ou par d’autres mécanismes tels les variations quotidiennes dans la sécrétion de la LH (197).

Enfin, il est aussi intéressant de noter dans le cadre de cette dissertation qu’il a été démontré que CLOCK a la capacité de répondre rapidement et de moduler son effet en réponse à l’activation de la voie MAP par une PKC dépendante du calcium (198). Puisque l’importance de la voie PKC dans la régulation de Nr4a1 a été explorée dans ce projet, il convient de mentionner ici cette observation.

1.3.2.5. Les récepteurs nucléaires (NR)

Les récepteurs nucléaires sont une classe de molécules dont l’origine remonte très loin dans l’arbre de la vie. Ils jouent un rôle primordial dans la plupart des fonctions cellulaires, de la différenciation à la prolifération en passant par le métabolisme (199). Les membres de cette classe de molécules partagent une organisation semblable constituée d’une partie N-terminale contenant un domaine de transactivation, un domaine hautement conservé de liaison à l’ADN comprenant des doigts de zinc et un domaine C-terminal comprenant le site de liaison du ligand (199). Chez les humains, 48 récepteurs nucléaires sont encodés dans le génome (200).

Le premier récepteur nucléaire à avoir été cloné est le récepteur à œstrogène. Suite à une élégante expérience réalisée en 1961 par le laboratoire de Jensen et collaborateurs, où une molécule d’œstrogène radioactive a pu être suivie, de la circulation jusqu’aux organes génitaux féminins, notamment les ovaires et l’utérus. Il a ensuite été déterminé que l’œstrogène marqué s’accumulait, complexé a une protéine, au noyau des cellules (201). C’est en 1968 que le modèle moderne en deux étapes de la fonction des récepteurs nucléaires a été établi, dans une autre publication de Jensen et collaborateurs (201). Ce modèle stipule que

les récepteurs nucléaires stéroïdiens, en l’absence de signal, sont localisés dans le cytoplasme, liés à des protéines de la classe des HSP. La liaison d’un ligand change la conformation du récepteur et encourage la dissociation du complexe récepteur-chaperonne. Ceci permettra aux récepteurs nucléaires de former des dimères ainsi que d’exposer leur signal de transport nucléaire. Ces dimères vont ainsi pouvoir transloquer au noyau, ou ils pourront coopérer avec leurs coactivateurs et éventuellement se lier à leur séquence de reconnaissance sur le promoteur de gènes cibles. Là, ils ont le pouvoir d’activer ou d’inhiber la transcription dépendamment de l’hormone, du récepteur et des modifications post-traductionnelles de chacun de ces acteurs (201).

Les récepteurs nucléaires ont ceci de particulier qu’ils agissent aussi directement en tant que facteurs de transcription. Structurellement, ils possèdent 6 domaines bien définis comprenant un domaine de liaison au ligand (LBD), un domaine d’activation indépendant du ligand (AF-1), un domaine de liaison à l’ADN à doigt de zinc (DBD), un domaine d’activation dépendant du ligand (AF-2), un domaine pivot et une séquence C- terminale de fonction inconnue (202). Un schéma simplifié de la structure d’un récepteur nucléaire est présenté à la Figure 1.2.

Figure 1.2. Représentation schématique des différents domaines d’un récepteur nucléaire

AF1, domaine d’activation indépendant du ligand; DBD, domaine de liaison à l’ADN à doigt de zinc; AF2, domaine d’activation dépendant du ligand; Les récepteurs nucléaires partagent une organisation semblable constituée d’une partie N-terminale contenant un domaine de transactivation (AF1), un domaine hautement conservé de liaison à l’ADN

comprenant des doigts de zinc (DBD) et un domaine C-terminal comprenant le site de liaison du ligand (AF2) (177). Les récepteurs nucléaires agissent directement, seuls ou en paire, en tant que facteurs de transcription sur l’ADN.

Tous les récepteurs nucléaires reconnaissent la séquence consensus AGGTCA (glucocorticoïdes et minéralocorticoïdes) ou AGAACA (estrogène, hormone thyroïdienne, acide rétinoïque, vitamine D, ainsi que la plupart des autres récepteurs nucléaire) (203). La nomenclature internationale les distingue avec l’appellation, NRXYZ, ou NR signifie Nuclear Receptor, X désigne la classe, Y désigne la famille et Z le membre. Les récepteurs nucléaires, en particulier dans le contexte des cellules de Leydig ont fait l’objet d’une revue

extensive par les Drs Luc J. Martin et Jacques J. Tremblay (204). Pour les besoins présents, seuls les membres de la famille des récepteurs nucléaires orphelins NR4A seront décrits.

Enfin, il convient de brièvement mentionner que la signalisation par les récepteurs nucléaires ne se limite plus à leur rôle de facteur de transcription. En effet, un bon nombre d’indices a montré que dans certains contextes, les récepteurs nucléaires peuvent participer directement à des réponses de signalisation rapides au niveau du cytosol et des membranes plasmiques (205). Cet aspect de la fonction des récepteurs nucléaires ne sera pas abordé dans le cadre de cette dissertation.

1.3.2.6. Les récepteurs nucléaire de famille 4A (NR4A)

La famille NR4A comporte trois membres soient NR4A1 (NUR77, NGFI-B, TR3), NR4A2 (NURR1) et NR4A3 (NOR1). Le premier membre de cette famille, et le premier à avoir été identifié est NR4A1, originalement appelé NGFI-B (206). Il s’agit par ailleurs du membre de la famille NR4A qui est le mieux représenté dans la cellule de Leydig. Il a été identifié au départ comme un gène à réponse précoce ou immédiate, parce que son activation survient de façon très rapide dans plusieurs tissus suite à une stimulation. Chez les cellules de Leydig, il est assez reconnu que son activation ainsi que sa transcription seraient en bonne partie dépendants de la voie du calcium (129, 143, 144). Dans les cellules de Leydig, cette voie est stimulée par la liaison de la LH à son récepteur membranaire (207).

NR4A1 fait partie de la classe des récepteurs nucléaires orphelins, c’est-à-dire, des récepteurs nucléaires pour lesquels aucun ligand n’a été identifié (208). En raison de la présence de résidus hydrophobes dans la région normalement occupée par les ligands chez les autres familles de récepteurs nucléaires, NR4A1 est vraisemblablement constitutivement actif, et son activité est régulée par la présence de la protéine et de ses modifications post-traductionnelles (209, 210). Chez les cellules de Leydig, en réponse à une stimulation hormonale, la transcription du gène Nr4a1 et la traduction de son ARNm augmentent, ce qui résulte en l’élévation du niveau protéique de NR4A1 (143). Il en résulte l’accroissement de l’activité transcriptionnelle de différents gènes cibles.

NR4A1 peut se lier à l’ADN selon trois possibilités : en monomère à élément de réponse appelé NRE (AAAAGGTTCA), en dimère sur un élément de réponse de type ER10 imparfait appelé NurRE (TGATATn10ATGCCA) ou avec les récepteurs à acide rétinoïque sur la séquence AGGTCAn0-6AGGTCA, comme plusieurs autres récepteurs nucléaires (210).

Des évidences montrent qu’en plus de pouvoir interagir en dimère avec d’autres récepteurs nucléaires, NR4A1 a la capacité de coopérer avec d’autres facteurs de transcription de façon à en moduler l’action. À titre d’exemple, NR4A1 est capable de s’associer avec le complexe AP-1 sur le promoteur Star et contribue de façon synergique à son activation (169). Au niveau des cellules de Leydig, il semblerait que l’expression de plusieurs de gènes nécessaires à la stéroïdogenèse soit régulée par NR4A1. On peut nommer parmi ceux-ci Hsd3b2, Hsd3b1, Cyp17a1, Star, Insl3 et Giot1 (211). La transcription de plusieurs de ces gènes a d’ailleurs été caractérisée dans le laboratoire du Dr Jacques J. Tremblay.