Ma maitrise m’a premièrement permis d’apprendre un grand nombre de techniques de laboratoire, en plus de cristalliser les principes de la recherche scientifique. Ce faisant, j’ai été en mesure de contribuer à différents travaux de recherche.
En premier lieu, j’ai contribué à la construction de plusieurs plasmides qui ont été utiles dans le cadre d’au moins deux articles publiés. Par ailleurs, j’ai participé au maintien de l’intégrité de la banque de plasmides du laboratoire en restaurant la séquence sauvage de l’une des constructions les plus utiles utilisés pour l’étude du promoteur proximal de Nr4a1 IA.
En second lieu, j’ai pu évaluer l’effet de la transfection d’un vecteur d’expression pour SRF sur l’activité du promoteur Nr4a1. SRF était un facteur prometteur étant donné l’origine de la découverte de NR4A1 dans les cellules neuronales, en réponse à la présence de facteurs de croissance. À première vue, il ne semblerait pas que SRF soit responsable de cette réponse dans les cellules de Leydig.
Malgré tout, le facteur de transcription SRF était un candidat intéressant pour l’expression de Nr4a1. D’une part parce qu’il est reconnu que les RTK impliqués dans la transduction de signaux liés aux facteurs de croissance sont responsables d’une partie de la réponse hormonale de Nr4a1, notamment via les kinases de la famille MAP et d’autre part parce que NR4A1 a été découvert à cause de sa rapide et forte réponse aux facteurs de croissance, tels que ceux contenus dans les sérums de culture cellulaire. Qui plus est, un site de liaison à l’ADN pour SRF bien conservé est aussi présent sur le promoteur Nr4a1 IA, ce qui appuyait le potentiel régulateur de ce facteur. Cependant, la surexpression de SRF n’a pas permis de démontrer une augmentation de l’activité promotrice de Nr4a1 IA dans les cellules de Leydig MA-10.
En troisième lieu, j’ai pavé le chemin pour la caractérisation fine de deux nouveaux promoteurs associés à l’expression de Nr4a1 qui ont été identifiés dans le tissu cardiaque murin et qui a été détecté dans les cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1. Pour le promoteur Nr4a1 IB, le plus proximal, j’ai pu déterminer deux régions d’environ 200 pb qui sont responsables respectivement de l’activité basale et de la réponse hormonale des promoteurs en question. Pour le promoteur Nr4a1 IC, j’ai identifié une région d’environ 200 pb qui est responsable de la réponse hormonale. Des travaux d’optimisation sont cependant nécessaires afin de pouvoir déterminer les zones importantes pour l’activité basale de ces promoteurs, ceci entre autres à cause de la faiblesse du signal luciférase obtenu.
En quatrième lieu, j’ai effectué bon nombre d’expérience avec des inhibiteurs de kinases qui m’ont permis de potentiellement rallier des observations apparemment contradictoires obtenues via essais luciférases et par PCR quantitatif. En effet, l’effet d’une inhibition de PKC se voit sur l’activité du promoteur Nr4a1 IB, mais pas sur le promoteur Nr4a1 IA. Parallèlement, l’inhibition de PKC a un effet sur la quantité d’ARNm total de Nr4a1 (toutes isoformes confondues) Ainsi, il est possible que l’activité du promoteur Nr4a1 IB soit responsable d’une quantité importante du transcrit d’ARNm total de Nr4a1. Qui plus est, des expériences supplémentaires pour déterminer l’effet de l’AMPK et de divers facteurs de transcription importants pour l’activité du promoteur Nr4a1 IA devraient être effectués sur le promoteur Nr4a1 IB, en plus d’essais quantitatifs afin de déterminer précisément la quantité relative d’ARNm provenant de chacun des transcrits identifiés.
En cinquième lieu, j’ai pu élucider certaines questions quant à l’utilité probable de certains facteurs de transcription de la famille CLOCK, BMAL1 et MAF dans les cellules de Leydig. Il ressort de ces expériences que le facteur de transcription CLOCK pourrait avoir un effet modeste sur l’activation des promoteurs Nr4a1 IA et Nr4a1 IB, mais pas sur Nr4a1 IC. Quant au facteur de transcription BMAL1, il ne semble pas pouvoir activer seul l’activité des différents promoteurs testés.
Les facteurs de transcription impliqués dans le cycle circadien ont été identifiés dans le passé comme étant importants pour certains processus physiologiques de la reproduction. Par ailleurs, la sécrétion de LH obéit elle-même à un profil circadien. Ces éléments font qu’il était tentant d’évaluer l’effet de ces facteurs sur l’expression de Nr4a1. Il en résulte que dans les cellules de Leydig, la présence de CLOCK et BMAL1 pourrait avoir une importance sur la stéroïdogenèse en régulant l’activité des promoteurs alternatifs de Nr4a1 et donc l’expression de ce gène. Cependant, des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de tirer des conclusions plus solides sur leur implication, seuls et de concert, sur l’activité promotrice des promoteurs alternatifs de Nr4a1.
Les facteurs de transcription de la famille MAF ayant été identifiés comme marqueurs des cellules de Leydig fœtales et étant des facteurs importants dans la balance hormonale dans d’autres tissus, notamment le pancréas, leur étude dans le cadre de la régulation moléculaire de la stéroïdogenèse était appropriée. Il semblerait cependant que les deux membres exprimés dans les cellules de Leydig MA-10 capables de fortement activer le promoteur Nr4a1 IA ainsi que le promoteur Star. Ceci soulève plusieurs questions quant au mécanisme de régulation par lequel c-MAF peut réguler ces gènes. Tel que mentionné précédemment, il est possible que c-MAF agisse soit directement sur la machinerie transcriptionnelle, soit via des sites de liaisons qui n’ont pas encore été caractérisés. Dans le cas de Nr4a1 IA il se pourrait que cette activation soit due à la présence de sites AP-1 contenus dans les 121 paires de bases en amont du site d’initiation de la transcription. Plus vraisemblablement, il s’agit d’une activité due à une interaction avec la machine transcriptionnelle, ce qui expliquerait l’effet universel observé sur les promoteurs testés.
En dernier lieu, j’ai pu réaliser l’immunoprécipitation de NR4A1 dans les cellules de Leydig MA-10 et démontrer que l’activation hormonale par l’AMPc et le hCG permettait d’enrichir NR4A1 dans les extraits nucléaires. Cependant, aucune modification post-traductionnelle n’a pu être détectée par spectrométrie de masse réalisée par la plateforme de protéomique du centre de recherche du CHU de Québec. Des changements à la méthodologie utilisée devront être apportés afin de pouvoir détecter des changements post- traductionnels attendus.
Pour les prochaines étapes, il conviendra de terminer la caractérisation du promoteur Nr4a1 IB et de finir de mettre au point les conditions nécessaires à l’étude du promoteur Nr4a1 IC en condition basale. Ensuite, il serait important de réitérer la série d’expérience sur l’activité promotrice du promoteur Nr4a1 IA sur les promoteurs alternatifs IB et IC, afin de déterminer comment la régulation de l’activité des différents promoteurs diffère. Ensuite, tel que mentionné, il conviendra d’établir l’importance relative de chacun des transcrits dans
l’expression totale de Nr4a1. Une fois ces expériences réalisées et les conditions bien établies, l’utilisation d’ARN interférant (siRNA) serait une bonne façon de complémenter les expériences faites avec des inhibiteurs de kinases afin d’évaluer si une expression moindre des kinases endogènes peut reproduire l’effet observé avec les inhibiteurs. Éventuellement, une étude plus approfondie de l’importance de BMALI et CLOCK semble aussi être de mise puisque les expériences préliminaires pourraient suggérer une modeste activation des promoteurs alternatifs de Nr4a1 au moins par CLOCK. Sachant que CLOCK et BMAL1 interagissent de concert dans plusieurs tissus, il serait important de déterminer s’ils peuvent agir en synergie dans les cellules de Leydig. Ensuite, tel que mentionné précédemment, une approche de knockdown afin de confirmer l’effet des protéines de la famille MAF sur l’activité basale des promoteurs alternatifs de Nr4a1 (et potentiellement d’autres gènes) serait pertinente. Enfin, NR4A1 étant une protéine dont l’activation dépend fortement de changements post-traductionnels, il serait important de développer une meilleure expertise pour l’étude des phosphoprotéines dans le laboratoire. Pour ce faire, il faudra essayer plusieurs méthodes d’enrichissement et déterminer laquelle est la plus appropriée pour NR4A1.