Constructions plasmidiques

Plasmides rapporteurs couplés à la luciférase

Tous les plasmides rapporteurs couplés à la luciférase utilisés sont construits à partir d’un vecteur sans promoteur PXP1 modifié afin éliminer la présence de sites GATA cryptiques en amont du SMC, tel que décrit dans la publication du Dr Jacques J. Tremblay et du Dr Robert Viger (32).

2.1.1. Génération de délétants du promoteur Nr4a1 IA

Beaucoup de travail a déjà été décrit quant aux différentes constructions de Nr4a1 IA disponibles dans le laboratoire du Dr Jacques J. Tremblay. Ces constructions sont résumées aux Figure 2.1 et Figure 2.2. Par ailleurs, plusieurs de ces constructions ont été utilisées et décrites précédemment (143).

Figure 2.1. Liste des délétants du promoteur Nr4a1 IA construits dans le laboratoire de Jacques J. Tremblay. NIR, Nur77 (Nr4a1) important region. Les flèches représentent le site d’initiation de la transcription; l’étoile dénote une construction qui a dû être reconstruite car tous les échantillons du laboratoire pour ce plasmide avaient été égarés.

Une des constructions utilisées dans les travaux du Dr Luc J. Martin n’a pu être localisée et a dû être reconstruite (-233 pb, marquée d’une étoile à la Figure 2.1). Un temps d’élongation de 1 minute par kb a été utilisé pour effectuer la réaction PCR. Les amorces et les détails de la réaction d’amplification nécessaires pour l’obtention du délétant sont répertoriés au Tableau 2.1. Le délétant a été confirmé par séquençage (Plateforme de séquençage du centre de recherche du CHUL, Québec, Canada).

Tableau 2.1. Oligonucléotides utilisés pour la construction d’un délétant de la région promotrice de Nr4a1 IA

Délétant du promoteur

Nr4a1 IA Oligonucléotide sens

Température d’amorce

-233 pb 5'- CGC GGA TCC GGT CAC GCG CGC AGA CAT TC -3' 62 °C

Oligonucléotide anti-sens Amorce

commune 5'- CCG GTA CCG CGT GCG CTC TGC AAT CCT TC -3' Selon l’amorce sens Les sites de clonages sont en italiques : BamHI pour les oligonucleotides sens et Kpnl pour l'oligonucleotide anti-sens.

2.1.2. Génération de délétants du promoteur Nr4a1 IB

Un fragment de 1304 pb du promoteur Nr4a1 IB a été cloné dans un vecteur pXP1 modifié (décrit précédemment) par Nicholas Robert et collaborateurs (213). Des clonages subséquents de cette construction ont été effectués afin d’obtenir une collection de clones délétants en 5’ pour le promoteur Nr4a1 IB. La collection de clones est constituée des délétants suivants : -994 pb, -791 pb, -583 pb, -393 pb, -195 pb, -91 pb. Leur numérotation correspond à la position de l’amorce avant par rapport au site d’initiation de la transcription. Le site d’initiation de la transcription a été identifié dans le cas du promoteur Nr4a1 IB par la méthode de 5’ RACE par l’équipe allemande Söker et collaborateurs (212). Un temps d’élongation de 1 minute par kb a été utilisé pour effectuer les réactions PCR. Les amorces et les détails de la réaction d’amplification nécessaires pour l’obtention des délétants sont répertoriés au Tableau 2.2. Tous les délétants ont été confirmés par séquençage (Plateforme de séquençage du centre de recherche du CHUL, Québec, Canada).

Tableau 2.2. Oligonucléotides utilisés pour la construction des délétants de la région promotrice de Nr4a1 IB

Délétants du promoteur

Nr4a1 IB Oligonucléotide sens

Température d’amorce

-994 pb 5'- GCG GAT CCG GTC TAC AGA GTG AGT TCC -3' 61 °C

-791 pb 5'- GCG GAT CCA CAG GTT GAG AAC CAC TG -3' 62 °C

-583 pb 5'- GCG GAT CCT GGG AGT CAG CTT CG -3' 62 °C

-393 pb 5'- GCG GAT CCT GGC TTC CTG AGA CC -3' 61 °C

-195 pb 5'- GCG GAT CCC AGG GTC ATG CTC ACT CTG G-3' 59°C

-91 pb 5'- GCG GAT CCC GGT CCC CAG AGG CCA G -3' 64 °C

Oligonucléotide anti-sens Amorce

commune 5'- CGG GTA CCA ACT CTG GAT GGG AAC TG -3' Selon l’amorce sens Les sites de clonages sont en italiques : BamHI pour les oligonucleotides sens et Kpnl pour l'oligonucleotide anti-sens.

2.1.3. Génération de délétants du promoteur Nr4a1 IC

Un fragment de 1050 pb du promoteur Nr4a1 IC a été cloné dans un vecteur pXP1 modifié (décrit précédemment) par Nicholas Robert et collaborateurs (213). Des clonages subséquents de cette construction ont été effectués tel que décrit précédemment. La collection de clones délétants en 5’ pour le promoteur Nr4a1 IB est constituée de délétants de -810 pb -612 pb -394 pb et -103 pb. Leur numérotation correspond à la position de l’amorce avant par rapport au site d’initiation de la transcription. Le site d’initiation de la transcription a été déterminé par approche bio-informatique ainsi que par homologie avec le transcrit équivalent humain, tel que décrit dans la publication de Söker et collaborateurs (212). Un temps d’élongation de 1 minute par kb a été utilisé pour effectuer les réactions PCR. Les amorces et les détails de la réaction d’amplification nécessaires pour l’obtention des délétants sont répertoriés au Tableau 2.3. Tous les délétants ont été confirmés par séquençage (Plateforme de séquençage du centre de recherche du CHUL, Québec, Canada).

Tableau 2.3. Oligonucléotides utilisés pour la construction des délétants de la région promotrice de Nr4a1 IC

Délétants du promoteur

Nr4a1 IC Oligonucléotide sens

Température d’amorce

-810 pb 5'- GCG GAT CCC AAT GAT GAT GCA TAG CAA CG -3' 62 °C

-612 pb 5'- GCG GAT CCC TGA CAA AGA AGC AGG G -3' 63 °C

-394 pb 5'- GCG GAT CCC TGT AAG GAA GGA CAG G -3' 62 °C

-103 pb 5'- GCG GAT CCT CCA CAG GCC ACC ATG -3' 63 °C

Oligonucléotide anti-sens Amorce

commune 5'- CGG GTA CCA CTC ACA ACA TCC CCT CA -3' Selon l’amorce sens Les sites de clonages sont en italiques : BamHI pour les oligonucléotides sens et Kpnl pour l'oligonucléotide anti-sens.

2.1.4. Mutagenèse dirigée du promoteur Nr4a1 IA

Afin de mieux comprendre la régulation de l’activité du promoteur Nr4a1 IA, différentes combinaisons de mutations ont été réalisées sur le promoteur sauvage de -331 pb. Certains mutants du promoteur Nr4a1 IA avaient déjà été réalisés et sont résumés à la Figure 2.2. Deux constructions additionnelles ont été synthétisées dans le cadre de ce projet et son identifiées par une étoile à la Figure 2.2. Les mutagenèses dirigées du promoteur Nr4a1 IA ont été effectuées avec le système Quikchange II XL de la compagnie Aligent (Agilent Technologies Canada Inc., Mississauga, ON), en suivant les spécifications du manufacturier. Un temps d’élongation de 2 minutes par kb a été utilisé. Les amorces et les détails de la réaction d’amplification nécessaires pour l’obtention des délétants sont répertoriés au Tableau 2.4. La construction comprenant une mutation unique au site AP-1 situé à -255 pb a été faite à partir du promoteur sauvage de -331 pb, tandis que le triple mutant AP-1 a été réalisé à partir du promoteur contenant déjà une double mutation AP-1 aux positions -233 pb et -91 pb (TL-115, et TL-476, respectivement sur la Figure 2.2). Les deux mutants ont pu être construits avec la même paire d’amorce, puisque le dernier nucléotide en 3’ de l’amorce sens ne comprend pas le site AP-1 à -233 pb.

Figure 2.2. Liste des mutants aux sites AP-1 du promoteur proximal Nr4a1 IA

NIR, Nur77 (Nr4a1) important region. Les flèches représentent le site d’initiation de la transcription; l’étoile dénote une construction qui a été construite dans le cadre de ce projet.

Suite au séquençage du promoteur Nr4a1 IA et à sa comparaison subséquente à la séquence génomique consensus disponible sur le portail BLAST de NCBI, une différence a été notée, située dans un site MEF2 situé dans NIR-A à -319 pb du site d’initiation de la transcription. Une mutagenèse dirigée a donc été produite afin de rétablir la séquence consensus sur le plasmide utilisé dans le laboratoire du Dr Jacques J. Tremblay. L’amorce utilisée pour cette expérience est décrite dans le Tableau 2.4. Tous les mutants ont été confirmés par séquençage (Plateforme de séquençage du centre de recherche du CHUL, Québec, Canada).

Tableau 2.4. Oligonucléotides utilisés pour la mutagenèse dirigée sur le promoteur Nr4a1 IA

Oligonucléotide sens Mutations site AP-1 à -255 pb

Séquence sauvage 5′-ACA ATC CGC GCT CCC TGC GTC AAT GGA ACC CCG CGT GCG-3′ Oligonucléotide pour

induire mutation 5′-ACA ATC CGC GCT CCC TGC acC AAT GGA ACC CCG CGT GCG-3′ Mutation site MEF2 à -319 pb

Séquence mutée 5’-CGA GAG GAA AAC TAT TTA cAG ATC AAA CAA TCC GCG CTC C-3’ Oligonucléotide pour

restaurer la séquence Wt 5'-CGA GAG GAA AAC TAT TTA TAG ATC AAA CAA TCC GCG CTC C-3' Wt, sauvage (wild type); Seulement les oligonucléotides sens sont répertoriés. Les bases mutées sont soulignées.

2.1.5. Génération du vecteur d’expression pour c-MAF

L’ADNc complet du gène c-Maf murin a été obtenu de la compagnie ThermoFisher Scientific (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, États-Unis d’Amérique) dans un plasmide pBlueScript. Le cadre de lecture ouvert de la protéine C-MAF est compris entre un site de clonage BamHI en 5’ et le premier site NheI en 3’. Le plasmide pBlueScript a été digéré selon les spécifications du manufacturier (New England Biolabs Ltd., Whitby, ON) et le fragment résultant a été sous-cloné dans un vecteur d’expression pcDNA3 entre le site BamHI et le site XbaI, qui a été détruit suite à la ligation (contient maintenant un demi-site NheI et un demi-site XbaI). Le vecteur d’expression résultant a été confirmé par séquençage (Plateforme de séquençage du centre de recherche du CHUL, Québec, Canada).

2.1.6. Autres construction plasmidiques utilisées

Les vecteurs d’expression pour les facteurs de transcriptions MAFB et MAFK ont été obtenus de la compagnie ThermoFisher Scientific (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, États-Unis d’Amérique). Les vecteurs d’expression pour PKCε (sauvage, constitutivement actif et dominant négatif) ainsi que pour la protéine SRF ont été obtenus de la compagnie AddGene (AddGene, Cambridge, Massachusetts, États-Unis d’Amérique). Les vecteurs d’expression pour BMAL et CLOCK ont été obtenus de la compagnie AddGene (AddGene, Cambridge, Massachusetts, États-Unis d’Amérique). Le vecteur d’expression pour c-JUN a été obtenu du Dr Dany Chalbos (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Endocrinologie Moléculaire et Cellulaire des Cancers, Montpellier, France).

Les constructions pour le promoteur Star ont été gracieusement obtenues du laboratoire du Dr Robert Viger et ont été décrites (144). Dans le cadre de cette dissertation, seuls les délétants de -986 pb et de -54 pb ont été utilisés.