L’activation et l’inhibition de kinases a peu d’effet sur l’activité du promoteur Nr4a1 IA

Nr4a1 IA.

Les tendances observées dans les résultats précédents indiquent que la voie de PKC pourrait être importante pour l’augmentation des niveaux d’ARNm de Nr4a1 suite à une stimulation par l’hCG. Cependant, l’approche par PCR de la mesure des niveaux d’ARNm ne permet pas de distinguer si l’augmentation des niveaux d’ARNm est due à une augmentation de la transcription du gène (activité promotrice) ou une augmentation de la stabilité des ARNm. Pour tenter de répondre à cette question, des essais luciférases où les cellules de Leydig MA-10 transfectées de façon transitoire avec le promoteur Nr4a1 IA ont été stimulées par l’hCG en

présence d’inhibiteurs de kinases ont été réalisées. Cette expérience est donc analogue à celle détaillée dans la section 3.6.1. Les réponses observées suite à la stimulation par l’hCG et l’inhibition de PKC et PKA ont été comparées par un test de Kruskal-Wallis et les comparaisons multiples ont été réalisées par la méthode de Dunn. Ce choix est motivé par le petit échantillon, constitué de deux expériences réalisées en triplicata. On observe que l’activation du promoteur Nr4a1 IA est différente du témoin de façon statistiquement significative lorsque les cellules sont stimulées par l’hCG. Contrairement à ce qui a été observé au niveau de l’ARNm de Nr4a1 (incluant les transcrits issus des trois promoteurs alternatifs), aucune diminution de l’activité promotrice en réponse à l’hCG n’a été observée lorsque les cellules sont, en plus de l’hCG, traitées avec un inhibiteur de PKC (Figure 3.10). La stimulation du promoteur Nr4a1 IA par l’hCG n’est pas non plus affectée lorsque la PKA est inhibée par la présence de H-89 (Figure 3.10). Étant donné la longue demi-vie de la luciférase dans les cellules, il n’est pas possible d’effectuer une analyse du profil temporel tel qu’il est possible de le faire avec l’analyse des niveaux d’ARNm.

Figure 3.10. Effet des inhibiteurs de kinases sur l’activation par l’hCG du promoteur Nr4a1 IA couplé à la luciférase dans des cellules de Leydig MA-10 stimulées par l’hCG (N=2, essai à luciférase unique)

NIR, Nur77 (Nr4a1) important region. Les flèches représentent le site d’initiation de la transcription. Les comparaisons pour lesquelles les différences sont statistiquement significatives (p-value ≤0.05) sont mises en évidence par un astérisque. Les cellules de Leydig MA-10 ont été incubées dans un milieu sans sérum pour 1.5 h avant les traitements pharmacologiques. Les cellules de Leydig MA-10 ont été transfectées de façon transitoire avec un plasmide rapporteur pour le promoteur Nr4a1 IA (-331 pb). Les cellules ont été traitées avec un témoin (barre gris pâle), l’hCG seul (100 ng/ml, barre gris foncé) ou en combinaison avec un inhibiteur de PKC (bisindolylmaléimide I, 200 nM, barre bleu foncé), ou un inhibiteur de PKA (H-89, 10 µM, barre bleu pâle) pour une durée de 120 minutes. Tous les témoins ont été ramenés à 1. Les résultats sont présentés en multiplicatif de l’activité par rapport au témoin et représentent la moyenne de deux expériences effectuées en triplicata (±SEM). Les inhibiteurs de PKC (bisindolylmaléimide I) et PKA (H-89) ne semblent pas avoir d’effet sur l’activité promotrice du promoteur Nr4a1 IA en présence de hCG.

De façon connexe avec les expériences réalisées au niveau de l’ARNm de Nr4a1 (voir Figure 3.9), la capacité de PKC à augmenter l’activité promotrice de Nr4a1 IA a été testée. Cette expérience a été réalisée dans des cellules de Leydig MA-10 via l’activation de la PKC par l’ajout de PMA, ainsi que par la transfection d’un

vecteur d’expression pour la PKC (avec ou sans PMA). Tel que mentionné dans l’introduction, la PKC la plus active dans les cellules de Leydig est la PKCε. C’est donc le vecteur correspondant qui a été choisi pour ces expériences. La construction du promoteur proximal Nr4a1 IA ainsi que le promoteur minimal Nr4a1 IA ont été utilisés pour cette expérience. Les réponses suite à la transfection et à l’activation de la PKC par le PMA ont été comparées par un test de Kruskal-Wallis et les comparaisons multiples, par rapport au témoin seulement, ont été réalisés par la méthode de Dunn. Ce choix est motivé par le petit échantillon, constitué de deux expériences réalisées en triplicata. En accord avec les données présentées dans la Figure 3.9, la surexpression dans les cellules de Leydig MA-10 de la PKA, suivi d’une activation par le PMA a pu augmenter de façon statistiquement significative l’activité du promoteur proximal Nr4a1 IA (Figure 3.11). En revanche, l’activité du promoteur minimal de Nr4a1 IA ne change pas de façon statistiquement significative lorsque soumise au même traitement (Figure 3.11). Ceci indique que des éléments de régulation dépendants de la présence et de l’activation de PKC sont présents dans le promoteur proximal de Nr4a1 IA. Bien que l’activation du promoteur Nr4a1 IA augmente de façon statistiquement significative suite à la transfection d’un vecteur exprimant la PKC et à son activation avec le PMA, cette activation est modeste, de l’ordre d’un multiplicatif d’activation de deux par rapport au témoin.

Figure 3.11. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase du promoteur Nr4a1 IA dans les cellules de Leydig en réponse à une stimulation par le PMA et présence d’un vecteur d’expression pour PKCε

NIR, Nur77 (Nr4a1) important region. Les flèches représentent le site d’initiation de la transcription. Les comparaisons pour lesquelles les différences sont statistiquement significatives (p-value ≤0.05) sont mises en évidence par un astérisque. Les cellules de Leydig MA-10 ont été transfectées de façon transitoire avec une construction du promoteur proximal Nr4a1 IA (TL-115) ou avec une construction du promoteur minimal Nr4a1 IA (TL-113). En plus, 125 ng d’un vecteur d’expression témoin (pCDNA3, barres gris pâle et gris foncé), ou exprimant le gène Pkcɛ sous le contrôle d’un promoteur CMV (barres bleu foncé et bleu pâle) Les cellules ont été incubées en présence de PMA (20 nM) pour une durée de 120 minutes (barres gris foncé et bleu pâle) et comparées au témoin (barre gris pâle). Les résultats sont

présentés en multiplicatif de l’activité par rapport au témoin et représentent la moyenne de deux expériences effectuées en triplicata (±SEM).