4.1. Deux sites AP-1 du promoteur Nr4a1 IA contrôlent la majorité
de la réponse à l’AMPc
Bien que les trois sites AP-1 dans le promoteur Nr4a1 IA et leur importance dans la réponse à l’AMPc aient été décrits dans le passé, les vecteurs contenant des mutations ciblées demeurent d’importants outils. Sachant qu’une vaste partie de la réponse hormonale de Nr4A1 est causée par l’AMPc l’utilisation de ces vecteurs peut permettre de mieux comprendre quels sont les facteurs de transcription importants se liant à ces sites, ainsi que d’identifier d’autres sites et facteurs de transcription clés en éliminant la réponse spécifique à
ces sites. Cette logique a été bien décrite dans les travaux récents du Dr Houssein Abdou et collaborateurs (154). Plusieurs des mutants avaient été préalablement produits à partir du promoteur sauvage décrit dans les travaux de Luc J. Martin et collaborateurs (143). Suite à la synthèse des deux dernier mutants (marqués d’une étoile à la Figure 2.2 et à la Figure 3.1) mutés au site AP-1 situé à -255 pb (TL-474) ainsi qu’aux trois sites AP- 1 (situés à -91 pb, -233 pb et -255 pb; TL-493) des essais luciférase ont été faits afin de déterminer le profil d’activation par le 8-Bromo-cAMP des différents promoteurs Nr4a1 IA mutants par rapport au témoin non traité. Des analyses exploratoires comparant le niveau d’activation par le 8-Bromo-cAMP pour les différents promoteurs ont aussi été effectuées.
Les résultats obtenus à la suite de ces essais luciférase montrent que la mutation des deux sites distaux situés à -255 pb et -233 pb résultent en la perte de la capacité d’activation du promoteur Nr4a1 IA par l’AMPc, qui n’est plus différente de façon statistiquement significative de l’activation observée sur le promoteur minimal de -65 pb. Inversement, la mutation du site le plus proximal situé à -91 pb résulte en une activation par l’AMPc différente de façon statistiquement significative de celle observée avec le promoteur minimal de -65 pb. Par contre, cette activation ne diffère pas de façon statistiquement significative de celle observée sur le promoteur sauvage de -331 pb.
Ceci supporte largement les conclusions obtenues dans d’autres expériences (143, 153, 214) et a préparé le matériel nécessaire à des travaux subséquents dans le laboratoire du Dr. Jacques J. Tremblay (154). Tel que mentionné, la logique derrière la réalisation de cette expérience était liée à la nécessité d’avoir au laboratoire les outils nécessaires pour pousser plus loin la compréhension l’importance des sites AP-1 dans l’activité promotrice et leur implication, notamment, dans la signalisation dépendante du calcium. Dans la mesure où cette construction était nécessaire, mon travail a permis de compléter la collection et de maitriser la technique de mutagenèse dirigée. Cette expérience s’est montrée fructueuse à cet égard.
4.2. La surexpression de SRF dans les cellules de Leydig MA-10
ne stimule pas l’activité du promoteur proximal Nr4a1 IA
Le promoteur Nr4a1 IA comprend un site de liaison bien conservé pour le facteur de transcription SRF à 115 pb en amont du site d’initiation de la transcription, tel que démontré par l’analyse de la séquence promotrice de Nr4a1 IA. Le facteur de transcription SRF est généralement activé par l’augmentation des niveaux de calcium intracellulaires (180). Il a aussi été démontré que SRF peut réguler l’expression de certaines protéines de la famille JNK, notamment la protéine c-Jun N-terminal Kinase (JNK3), exprimée dans le testicule. Il était
donc plausible que la transfection transitoire de ce facteur de transcription puisse avoir un effet sur la régulation de la transcription de Nr4a1.
Les résultats des expériences effectuées montrent cependant que l’ajout de SRF ne stimule pas l’activité du promoteur Nr4a1 sauvage de -331 pb, tel que présenté à la Figure 3.7. Ceci pourrait être expliqué par la présence d’autres facteurs qui rendent indisponible la boite CArG nécessaire à la liaison de SRF. Par ailleurs, des évidences ont montré que SRF possède un profil de liaison à l’ADN qui semble être tissu spécifique, vraisemblablement en fonction de la disponibilité de certains cofacteurs dont ceux de la famille des facteurs de transcription Ets (E26 transformation-specific) et de la famille GATA. Les facteurs de la famille Ets sont ubiquitaires, mais ceux de la famille GATA sont généralement tissu spécifiques. Dans le cas des cellules de Leydig, la présence de GATA 4 a été démontrée, ainsi que son importance pour la stéroïdogenèse via une coopération avec le facteur de transcription MEF2 sur le promoteur du gène Star. Cependant, il ne semble pas que GATA4 soit impliqué dans la régulation la transcription de Nr4a1 IA. Il en résulte que la présence d’une boîte CArG ne semble pas être suffisante pour permettre l’activation de la transcription de Nr4a1 IA. Il se pourrait qu’une activité synergique en présence de calcium ou de CAMK1 puisse exister, mais cette expérience n’a pas été réalisée. Ceci n’est cependant pas supporté par les évidences obtenues dans des thymocytes, où la délétion du gène Srf ne semble pas influencer l’activation de la transcription de Nr4a1 (238).
Finalement, peu d’évidences existent quant à la présence de SRF dans les testicules et plus particulièrement dans les cellules de Leydig. Il est donc possible que malgré la présence d’un site de liaison pour SRF bien conservé dans le promoteur de Nr4A1, l’étude de son effet dans les cellules de Leydig ne soit pas entièrement pertinente. D’autres expériences visant à mettre en évidence la présence de SRF dans les cellules de Leydig seraient importantes à réaliser. Considérant la présence de SRF, il serait aussi intéressant d’investiguer son implication dans la suppression de l’activation de la transcription de Nr4a1 via son effet sur la protéine JNK3, connue pour inhiber la capacité de liaison à l’ADN de c-JUN via la phosphorylation d’un site C-terminal (239).
4.3. La restauration du site MEF2 de NIR-A à la séquence
consensus ne change pas l’intensité de l’activation du
promoteur proximal Nr4a1 IA par l’AMPc
Les résultats de l’analyse démontrent qu’il n’y a pas de différence dans la réponse à l’AMPc entre les deux plasmides testés, soient le plasmide original du laboratoire et celui retourné à la séquence consensus du promoteur de rat selon NCBI par mutagenèse dirigée. Le site de liaison pour le facteur de transcription MEF2
est 5’-YTA WWW WTA R-3’. La séquence du plasmide original du laboratoire était 5’-CTA TTT ACA G-3’, tandis que celle de la séquence consensus de NCBI était 5’-CTA TTT ATA G-3’. Cette mutation étant présente sur toutes les constructions du laboratoire étant issues de la construction initiale du promoteur Nr4a1 IA, il était donc important d’en vérifier l’effet. MEF2 régule l’activité promotrice de Nr4a1 IA lorsque les cellules de Leydig sont stimulées par l’AMPc, via une coopération avec la CAMK1 (214). Puisque qu’aucune différence entre la construction du laboratoire (mutée) et celle retournée à la séquence consensus n’a été observée dans les expériences réalisées avec le 8Br-AMPc rapportées à la Figure 3.3, et que toutes les autres expériences impliquant MEF2 ont été réalisées avec succès en utilisant les constructions du laboratoire (contenant une mutation), il semblerait que cette mutation ponctuelle n’empêche pas MEF2 d’effectuer son action sur l’activité promotrice de Nr4a1 IA.
D’autres expériences comparant l’activité promotrice de Nr4a1 IA avec ou sans surexpression de MEF2 et CAMK1 seraient aussi pertinentes à réaliser afin de savoir si l’activité de MEF2 serait plus forte avec la construction retournée à la séquence consensus. Cependant, ces expériences n’ont pas été réalisées à ce jour.
4.4. Identification de nouveaux transcrits de Nr4a1 dans les
lignées de cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1
L’activité basale du promoteur Nr4a1 IB est principalement contrôlée par deux régions distinctes situées entre les positions -393 à -195 pb et -195 pb et -91 pb (Figure 3.4). La première de ces régions contient vraisemblablement un élément répresseur, qui expliquerait la hausse de l’activité basale du délétant de -195 pb par rapport aux plus longs fragments du même promoteur (-393 pb à -1300 pb). La seconde région contient vraisemblablement les éléments nécessaires à l’activité basale car la délétion de -195 pb à -91 pb réduit à moins de 25% l’activité détectée par rapport au promoteur pleine longueur de -1300 pb et à moins de 10% par rapport au délétant de -195 pb, qui montre l’activité la plus élevée des délétants testés.
L’activité promotrice hormonalement stimulée de Nr4a1 IB a été évaluée à la fois via l’activation par l’AMPc et par l’hCG. Ceci avait pour but de déterminer l’importance relative de la voie de l’AMPc, dont l’importance pour l’activité du promoteur Nr4a1 IA a été bien décrite, par rapport à la signalisation provenant de l’activation plus globale issue directement de l’activation du récepteur de la LH (qui inclut vraisemblablement d’autres voies que celle de l’AMPc). On peut conclure de ces expériences que l’activité du promoteur Nr4a1 IB est hormonalement régulée, de façon similaire au promoteur Nr4a1 IA. À cet effet, une augmentation entre 8 et 12 fois supérieure à celle du témoin a été détectée pour l’activité du promoteur de -1304 pb lors d’une stimulation
par l’AMPc et l’hCG, respectivement. L’utilisation de délétants a permis de déterminer que la vaste majorité de la réponse hormonale du promoteur Nr4a1 IB est régulée dans la région comprise entre -500 pb et -393 pb (Figure 3.5). On retrouve dans cette région un site de type AP-1 bien conservé (à -461 pb du site d’initiation de la transcription), qui pourrait potentiellement servir de site de liaison pour le facteur de transcription c-JUN, important pour la régulation de l’expression stimulée par l’AMPc du promoteur Nr4a1 IA.
Plusieurs expériences restent à effectuer afin de caractériser plus précisément la régulation hormonale du promoteur Nr4a1 IB. Notamment, la transfection transitoire d’un vecteur d’expression pour c-JUN et la mutagenèse dirigée pour ses potentiels sites de liaisons seraient de mise. Ensuite, des expériences de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) pourraient confirmer que c-JUN peut bel et bien se lier au site de liaison identifié.
Par ailleurs, on remarque une différence d’activité systématique et statistiquement significative entre l’activation par l’hCG et celle par l’AMPc, ce qui suggère l’importance d’autres voies de signalisation que celle de l’AMPc pour l’activité du promoteur Nr4a1 IB. Des essais avec inhibiteurs de kinases pourraient donc aider à suggérer les potentielles voies de signalisations impliquées dans cette activité additionnelle.
Les résultats quant au promoteur alternatif Nr4a1 IC sont moins clairs. La délétion progressive de séquences en amont du site d’initiation de la transcription n’affecte que très peu l’activité basale du promoteur Nr4a1 IC. Une possibilité est que le site d’initiation de la transcription identifié par le groupe de Söker et collaborateurs (212) par approche bio-informatique n’est pas valide. Ainsi, l’expression basale du gène serait due à des facteurs stochastiques. Une autre possibilité serait d’ordre méthodologique car la valeur absolue des signaux obtenus au luminomètre est très faible, lorsque comparée aux signaux obtenus avec les promoteurs Nr4a1 IA ou Nr4a1 IB. Ceci a expliqué le choix d’utiliser le JetPrime plutôt que la méthode de précipitation d’ADN au phosphate de calcium pour effectuer les expériences avec le promoteur Nr4a1 IC. Le JetPrime permet généralement d’avoir un meilleur taux de transfection et donc une augmentation de la force des signaux détectés. Dans le cas présent, les valeurs obtenues sont demeurées de faible intensité. Il est donc possible que ces dernières soient déjà au seuil minimal de détection de l’appareil et qu’une diminution de signal ne puisse être détectée. Il serait intéressant de reproduire l’expérience dans d’autres lignées cellulaires ou de modifier le protocole de transfection de façon à renforcer le signal. Actuellement, il serait imprudent de tirer des conclusions sur la régulation basale de l’activité du promoteur Nr4a1 IC avec les données disponibles.
L’activité promotrice hormonalement stimulée de Nr4a1 IC a été évaluée par l’hCG. Il a été possible d’observer que la hCG a permis d’augmenter de plus de 4 fois l’activité du promoteur Nr4a1 IC par rapport au témoin. Il a aussi été possible d’observer que l’activité du promoteur Nr4a1 IC est régulée presque entièrement dans la région comprise entre -1150 pb et -810 pb (Figure 3.12). On retrouve dans cette région un site de type AP-1 bien conservé qui pourrait potentiellement servir de site de liaison pour le facteur de transcription c-JUN. On retrouve aussi un site de liaison bien conservé pour le facteur de transcription NF-κB. Ce facteur de transcription bien connu pour être dépendant de l’activité de la PKC et de la voie des MAP kinases (240). Entre autres, il a été suggéré qu’il pourrait être important pour la régulation du promoteur Nr4a1 IA (173). Enfin, plusieurs sites de liaison pour le récepteur nucléaire RXR sont aussi présents dans cette région, ce qui peut potentiellement ouvrir la voie à une autorégulation par NR4A1 via une hétérodimérisation avec RXR. De façon similaire aux expériences subséquentes proposées pour le promoteur Nr4a1 IB, il serait pertinent d’évaluer la pertinence de chacun de ces sites sur l’activité hormonale du promoteur Nr4a1 IC.
4.5. Évaluation du rôle de différentes kinases dans la
transcription de Nr4a1.
Les résultats précédents indiquent que la voie de PKC est importante pour l’augmentation des niveaux d’ARNm de Nr4a1 suite à une stimulation par l’hCG. Cependant, l’approche PCR de mesure des niveaux d’ARNm ne permet pas de distinguer si l’augmentation des niveaux d’ARNm est due à une augmentation de la transcription du gène (activité promotrice) ou une augmentation de la stabilité des ARNm. Pour tenter de répondre à cette question, des expériences semblables ont été réalisées sur des constructions du promoteur de Nr4a1 IA couplés à la luciférase. Le promoteur Nr4a1 IA est bien stimulé par l’hCG mais contrairement à ce qui a été observé au niveau de l’ARNm de Nr4A1, aucune diminution de l’activité promotrice (où réduction de la réponse à l’hCG) n’est observée lorsque les cellules sont traitées avec un inhibiteur de PKC (Figure 3.10). Étant donné la longue demi-vie de la luciférase dans les cellules, il n’est pas possible d’effectuer une analyse du profil temporel tel qu’il est possible de le faire avec l’analyse des niveaux d’ARNm.
Dans une seconde expérience, nous avons tenté de corroborer l’effet de la PKC observé au niveau de l’ARNm de Nr4a1 en répliquant les conditions précédentes lors d’études de promoteur effectuées par transfection transitoire de vecteurs couplés à la luciférase dans les cellules de Leydig MA-10. Deux méthodes ont été employées : la transfection d’un vecteur d’expression codant pour la PKCε sauvage et l’utilisation de PMA (activateur de PKC) (Figure 3.11). Une difficulté de cette expérience réside en la dépendance de l’activation de PKC pour le DAG ainsi que pour le calcium. Il est peu probable que d’ajouter du calcium dans les cellules puisse permettre de discerner l’importance de la PKC dans la signalisation cellulaire. Ceci est dû notamment à
la CAMKI, que l’on sait être très importante pour l’expression de Nr4a1 et qui viendrait masquer l’effet que l’on compte observer. Un moyen de contourner ce problème pourrait être la transfection d’une version constitutivement active de la protéine kinase C. Cette expérience a été réalisée mais a résulté en une activation similaire entre le promoteur minimal et celui de 387 pb (activation entre 4 et 6 fois supérieure par rapport aux échantillons transfectés par un vecteur témoin; expérience non montrée).
Il est à noter que malgré le fait que la majorité de l’activité hormonale observée pour Nr4a1 résulte par le biais du récepteur à la LH, la vaste majorité des études ayant été réalisées dans les cellules de Leydig n’ont utilisé que des analogues de l’AMPc. Ceci exclut donc une partie de la signalisation cellulaire nécessaire à l’expression de Nr4a1 provenant des autres voies activées par le récepteur à la LH. En effet, de profondes différences peuvent être attendues entre les deux types de stimulations, puisque le récepteur de la LH déclenche d’autres voies de signalisation que celles de l’AMPc. Dans le cadre des expériences réalisées au cours de ce projet, l’hCG a été utilisé afin d’évaluer l’effet du de l’activation du LHR sur l’expression de Nr4a1, principalement pour des raisons pratiques. À cet égard, il convient de mentionner que des évidences ont montré que cette approche nécessite tout de même des précautions puisque l’usage de l’hCG, par opposition à l’usage de LH, tend aussi à favoriser la voie de l’AMPc (125). Cependant, au laboratoire, l’utilisation de l’hCG est généralement favorisée par rapport à la LH, qui est beaucoup plus coûteuse.
Suite à ce préambule, il convient de parler des évidences qui appuient l’hypothèse de voies supplémentaires à celle de l’AMPc dans la stimulation de l’expression de Nr4a1. Dans un premier temps, les stimulations par le hCG sont plus intenses en termes de la force du signal obtenu que celles obtenues lors d’une stimulation par un analogue de l’AMPc. Cette différence s’observe tant en transfections transitoires (activités promotrices) qu’en ARN messager. Ceci suggère l’activation d’un beaucoup plus grand nombre de voies de signalisation, qui seraient ultimement responsables de la différence de réponse observée entre les stimulations. On peut voir un tel exemple de stimulation plus forte avec l’hCG à la Figure 3.5 pour le promoteur Nr4a1 IB.
Dans un deuxième temps, lorsque l’on étudie les niveaux d’ARNm de Nr4a1 suite à une stimulation par l’hCG, on observe un profil temporel très transitoire. En effet, le maximum de la stimulation est atteint après une heure, et déjà à la deuxième heure, les niveaux d’ARNm de Nr4a1 reviennent au niveau basal (Figure 3.8). Ceci est en opposition aux observations faites lors d’une stimulation par le 8Br-cAMP. Ce type de stimulation résulte en une réponse de très longue durée, maintenue jusqu’à plus de 8 heures (153). Entre autres, ceci s’explique parce que ces analogues de l’AMPc sont plus résistants à la dégradation par la machinerie enzymatique (phosphodiestérases) des cellules et donc la stimulation persiste plus longtemps dans la cellule.
De nombreux éléments ont été proposés pour expliquer la diminution de la réponse hormonale suite à stimulation du récepteur de la LH (LHR). Parmi ces scénarios, on nomme l’internalisation du récepteur de la LH comme étant particulièrement important dans la régulation négative de son activité (241). Ceci constitue probablement une part de vérité, mais il faut se rappeler que la régulation de la transcription du gène du Lhcgr est auto-stimulée suite à l’activation du récepteur de la LH. Une des voies impliquées dans cette autorégulation est celle de NR4A1 (242). Finalement, une très faible quantité de LHR est nécessaire pour produire une réponse intracellulaire maximale (145). En plus, le devenir du récepteur internalisé semble être partagé entre la voie de la dégradation et de la récupération (243). Il en résulte qu’il est improbable que la réduction du signal suivant une stimulation hormonale soit due à l’absence complète du récepteur à la LH sur la membrane.
Ceci divise donc le paradoxe de l’expression de Nr4a1 en deux parties distinctes. La première de ces parties vient du fait que la stimulation aiguë par l’hCG augmente de façon beaucoup plus forte les niveaux d’ARNm de Nr4a1 que la stimulation par le 8Br-cAMP. La deuxième est que cette même stimulation par le hCG est inhibée de façon active par une des voies de signalisation activées par le hCG.
Un partenaire intéressant dans la régulation de cette dynamique est l’AMPK, une kinase dont le rôle est d’assurer l’homéostasie énergétique des cellules en détectant la quantité relative d’AMP et d’ATP dans le