Régulation fine du promoteur Nr4a1 de souris chez les
cellules de Leydig MA-10 et MTLC-1
Mémoire
François Péloquin
Maitrise en biologie cellulaire et moléculaire
Maitre ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
Régulation fine du promoteur Nr4a1 de souris chez les
cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1
Mémoire
François Péloquin
Sous la direction de :
Résumé
La stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig est liée au récepteur nucléaire NR4A1. Ce récepteur nucléaire régule la transcription du gène Star qui code pour une protéine essentielle à la stéroïdogenèse. L’expression de Nr4a1 est régulée par trois promoteurs distincts dont l’activité est hormonalement régulée. Deux de ces promoteurs ont été récemment décrits et ont été nommés Nr4a1 IB et Nr4a1 IC (le promoteur original a été renommé Nr4a1 IA). Des analyses qPCR ont montré que ces promoteurs sont actifs dans les cellules de Leydig MA-10 et qu’ils répondent à une stimulation hormonale. Ces promoteurs ont été isolés et fusionnés au gène rapporteur luciférase, et des délétions 5’ progressives ont été produites. Par transfections transitoires dans les cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1, deux zones régulatrices importantes ont été localisées pour le promoteur Nr4a1 IB : l’une pour l’activité basale et l’autre, pour l’activation hormonale par l’AMPc et la LH.
Bien que la transcription de Nr4a1 soit principalement activée par la voie de l’AMPc, une stimulation par la LH active d’autres voies qui peuvent influencer son profil d’expression. La majorité des études publiées n’ont pas exploré ces voies. À cet égard, la voie PKC est en mesure d’augmenter la quantité d’ARNm et l’activité promotrice de Nr4a1. Par ailleurs, l’inhibition des kinases PKA et PKC suite à une stimulation par la LH montre un profil d’ARNm qui peut être expliqué par l’existence du promoteur Nr4a1 IB récemment identifié dans les cellules de Leydig. Ces données supportent l’existence d’une régulation de l’expression de Nr4a1 impliquant d’autres seconds messagers que l’AMPc et le calcium.
Par ailleurs, de nouveaux facteurs de transcriptions ont été testés comme régulateurs des promoteurs alternatifs de Nr4a1. Ces facteurs de transcription son SRF, CLOCK et BMAL1, et c-MAF.
Table des matières
Résumé ... iii
Table des matières ... iv
Liste des figures ... vii
Liste des tableaux ... ix
Liste des abbreviations ... x
Remerciements ... xv Préface ... xvi 1. Introduction ... 1 1.1. Physiologie développementale ... 1 1.1.1. Développement précoce ... 1 1.1.2. Le développement de la gonade ... 1 1.1.3. La détermination sexuelle ... 2
1.1.4. La différenciation sexuelle masculine ... 3
1.1.5. Les cellules de Leydig ... 4
1.1.6. Les cellules de Sertoli ... 7
1.2. L’endocrinologie de la gonade... 8
1.2.1. L’axe hypothalamo-pituito-gonadique ... 10
1.2.2. Les récepteurs couplés aux protéines G ... 13
1.2.3. Les récepteurs à tyrosine kinase ... 14
1.2.4. La réponse à l’hormone lutéinisante ... 15
1.2.5. Seconds messagers ... 17
1.3. Les facteurs de transcription ... 21
1.3.1. Les facteurs généraux de transcription ... 21
1.3.2. Les facteurs spécifiques de transcription ... 22
1.4. La stéroïdogenèse ... 32
1.4.1. Les stéroïdes ... 32
1.4.2. Les étapes précoces de la stéroïdogenèse ... 33
1.4.3. La synthèse de stéroïdes actifs ... 35
1.5. Hypothèses de travail ... 36
2. Matériel et méthodes ... 38
2.1. Constructions plasmidiques... 38
2.1.1. Génération de délétants du promoteur Nr4a1 IA ... 38
2.1.2. Génération de délétants du promoteur Nr4a1 IB ... 39
2.1.3. Génération de délétants du promoteur Nr4a1 IC ... 40
2.1.4. Mutagenèse dirigée du promoteur Nr4a1 IA ... 41
2.1.5. Génération du vecteur d’expression pour c-MAF ... 43
2.1.6. Autres construction plasmidiques utilisées ... 43
2.2. Réactions PCR en vue d’évaluer la présence d’ARNm de c-Maf, Mafb, Mafk et Clock ... 43
2.3. Extraction et purification d’ADN sur gel d’agarose ... 44
2.4. Digestion et ligation des fragments PCR ... 45
2.5. Transformation de bactéries compétentes ... 45
2.6. Cultures cellulaires ... 45
2.7. Transfections transitoires ... 46
2.8. Traitements pharmacologiques ... 47
2.9. Extraits nucléaires ... 48
2.10. Quantification des extraits protéiques ... 48
2.11. Extraits d’ARNm et synthèse d’ADN complémentaire ... 48
2.12. PCR en temps réel ... 49
2.13. Immunoprécipitation ... 49
2.14. Immunobuvardage ... 50
2.15. Analyses statistiques ... 50
3. Résultats ... 51
3.1. Deux sites AP-1 du promoteur Nr4a1 IA contrôlent la majorité de la réponse à l’AMPc ... 51
3.2. La surexpression de SRF dans les cellules de Leydig MA-10 ne stimule pas l’activité du promoteur proximal Nr4a1 IA ... 52
3.3. La restauration du site MEF2 de NIR-A à la séquence consensus ne change pas l’intensité de l’activation du promoteur proximal Nr4a1 IA par l’AMPc ... 53
3.4. Identification de nouveaux transcrits de Nr4a1 dans les lignées de cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1 54 3.4.1. Activité basale du promoteur Nr4a1 IB ... 55
3.4.2. Régulation hormonale du promoteur Nr4a1 IB ... 55
3.5. Caractérisation fonctionnelle du promoteur alternatif Nr4a1 IC ... 56
3.5.1. Activité basale du promoteur Nr4a1 IC ... 57
3.5.2. Régulation hormonale du promoteur Nr4a1 IC ... 57
3.6.1. L’activation et l’inhibition de kinases module l’expression de Nr4a1 en réponse à une stimulation 58
3.6.2. L’activation et l’inhibition de kinases a peu d’effet sur l’activité du promoteur Nr4a1 IA. ... 60
3.6.3. L’inhibition de l’activité de la protéine kinase C module l’activité du promoteur Nr4a1 IB ... 63
3.7. Évaluation de l’implication de facteurs de transcription potentiels pour les promoteurs alternatifs de Nr4a1 64 3.7.1. Évaluation de la présence de l’ARNm de Clock et de l’effet d’un vecteur d’expression de CLOCK sur l’activité promotrice des trois promoteurs alternatifs de Nr4a1 ... 65
3.7.2. Évaluation l’effet d’un vecteur d’expression de BMAL1 sur l’activité promotrice des trois promoteurs alternatifs de Nr4a1 ... 69
3.7.3. Évaluation de la présence de l’ARNm de c-Maf, Mafb et Mafk et de l’effet de vecteurs d’expression pour c-MAF, MAFB et MAFK sur l’activité promotrice des trois promoteurs alternatifs de Nr4a1 73 3.8. NR4A1 est enrichi suite à une immunoprécipitation, mais aucune modification post-traductionnelle n’a été détectée par LC/MS/MS ... 80
4. Discussion ... 82
4.1. Deux sites AP-1 du promoteur Nr4a1 IA contrôlent la majorité de la réponse à l’AMPc ... 82
4.2. La surexpression de SRF dans les cellules de Leydig MA-10 ne stimule pas l’activité du promoteur proximal Nr4a1 IA ... 83
4.3. La restauration du site MEF2 de NIR-A à la séquence consensus ne change pas l’intensité de l’activation du promoteur proximal Nr4a1 IA par l’AMPc ... 84
4.4. Identification de nouveaux transcrits de Nr4a1 dans les lignées de cellules de Leydig MA-10 et MLTC-1 85 4.5. Évaluation du rôle de différentes kinases dans la transcription de Nr4a1. ... 87
4.6. Évaluation de l’implication de facteurs de transcription potentiels pour les promoteurs alternatifs de Nr4a1 90 4.7. NR4A1 est enrichi suite à une immunoprécipitation, mais aucune modification post-traductionnelle n’a été détectée par LC/MS/MS ... 94
4.8. Validité externe chez le modèle in vivo et chez l’humain... 95
5. Conclusion et perspectives ... 96
Liste des figures
Figure 1.1. Représentation de l’axe hypothalamo-pituito-gonadique. ... 12
Figure 1.2. Représentation schématique des différents domaines d’un récepteur nucléaire ... 28
Figure 1.3. Capacité de réponse à l’hCG de trois promoteurs alternatifs du gène Nr4a1 (213) ... 31
Figure 1.4. Représentation graphique des enzymes et divers intermédiaires de la stéroïdogenèse. ... 36
Figure 2.1. Liste des délétants du promoteur Nr4a1 IA construits dans le laboratoire de Jacques J. Tremblay. ... 38
Figure 2.2. Liste des mutants aux sites AP-1 du promoteur proximal Nr4a1 IA ... 42
Figure 3.1. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase de différentes constructions de mutants des sites AP-1 du promoteur proximal Nr4a1 IA dans les cellules de Leydig ... 52
Figure 3.2. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase du promoteur proximal Nr4a1 IA dans les cellules de Leydig MA-10 en présence d’un vecteur d’expression pour SRF ... 53
Figure 3.3. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase du promoteur proximal Nr4a1 IA avec ou sans la mutation dans le site MEF2 situé à -319 pb dans les cellules de Leydig. ... 54
Figure 3.4. Évaluation de l’activité promotrice basale par essai luciférase en duplex des délétants du promoteur Nr4a1 IB ... 55
Figure 3.5. Évaluation de l’activité promotrice stimulée par l’hCG et l’AMPc par essai luciférase en duplex des délétants du promoteur Nr4a1 IB ... 56
Figure 3.6. Évaluation de l’activité promotrice basale par essai luciférase en duplex des délétants du promoteur Nr4a1 IC ... 57
Figure 3.7. Évaluation de l’activité promotrice stimulée par l’hCG par essai luciférase en duplex des délétants du promoteur Nr4a1 IC ... 58
Figure 3.8. Effet à plusieurs points temporels des inhibiteurs de kinases sur les niveaux d’ARNm de Nr4a1 dans des cellules de Leydig stimulées par l’hCG... 59
Figure 3.9. Effet de l’activation de PKC par un ester the Phorbol sur la transcription de Nr4a1 dans les cellules de Leydig ... 60
Figure 3.10. Effet des inhibiteurs de kinases sur l’activation par l’hCG du promoteur Nr4a1 IA couplé à la luciférase dans des cellules de Leydig MA-10 stimulées par l’hCG (N=2, essai à luciférase unique) ... 61
Figure 3.11. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase du promoteur Nr4a1 IA dans les cellules de Leydig en réponse à une stimulation par le PMA et présence d’un vecteur d’expression pour PKCε ... 62
Figure 3.12. Effet des inhibiteurs de kinases sur l’activation par l’hCG du promoteur Nr4a1 IB couplé à la luciférase dans des cellules de Leydig stimulées par l’hCG ... 64
Figure 3.13.Amplification d’un fragment de l’ADNc de Clock dans des extraits provenant de cellules de Leydig ... 65 Figure 3.14. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IA par le facteur de transcription CLOCK dans des cellules de Leydig ... 67 Figure 3.15. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IB par le facteur de transcription CLOCK dans des cellules de Leydig ... 68 Figure 3.16. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IC par le facteur de transcription CLOCK dans des cellules de Leydig ... 69 Figure 3.17. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IA par le facteur de transcription BMAL1 dans des cellules de Leydig ... 71 Figure 3.18. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IB par le facteur de transcription BMAL1 dans des cellules de Leydig ... 72 Figure 3.19. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IC par le facteur de transcription BMAL1 dans des cellules de Leydig ... 73 Figure 3.20. Amplification d’un fragment de l’ADNc de Mafb et c-Maf dans des extraits provenant de cellules de Leydig et d’un testicule de souris adulte entier. ... 74 Figure 3.21. Amplification d’un fragment de l’ADNc de MAFK dans des extraits provenant de cellules de Leydig. ... 75 Figure 3.22. Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Nr4a1 IA par le facteur de transcription c-MAF dans des cellules de Leydig ... 76 Figure 3.23. Activation de délétants incrémentaux du promoteur Nr4a1 IA par les facteurs de transcription c-MAF et c-MAFk dans des cellules de Leydig ... 77 Figure 3.24.Courbe dose-réponse pour l’activation du promoteur Star par le facteur de transcription c-MAF dans des cellules de Leydig MA-10 ... 78 Figure 3.25. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase du promoteur Nr4a1 IB dans les cellules de Sertoli MSC1 en présence d’un vecteur d’expression pour c-MAF ... 79 Figure 3.26. Évaluation de l’activité promotrice par essai luciférase du promoteur Nr4a1 IB dans les cellules de Sertoli MSC1 en présence d’un vecteur d’expression pour c-MAF ... 79 Figure 3.27. Évaluation des niveaux protéiques de NR4A1 dans extraits nucléaires de cellules de Leydig MA-10 suite à la transfection d’un vecteur d’expression pour c-MAF, MAFk, ou une stimulation par l’hCG ou par le 8Br-AMPc ... 80 Figure 3.28. Augmentation des niveaux protéiques de NR4A1 dans extraits nucléaires de cellules de Leydig MA-10 suite à une stimulation par l’hCG et par le 8Br-AMPc ... 81 Figure 3.29. Présence de la protéine NR4A1 dans les échantillons suite à l’immunoprécipitation ... 82
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Propriétés régulatrices des adénylates cyclases des mammifères (147) ... 18 Tableau 2.1. Oligonucléotides utilisés pour la construction d’un délétant de la région promotrice de Nr4a1 IA 39 Tableau 2.2. Oligonucléotides utilisés pour la construction des délétants de la région promotrice de Nr4a1 IB ... 40 Tableau 2.3. Oligonucléotides utilisés pour la construction des délétants de la région promotrice de Nr4a1 IC ... 41 Tableau 2.4. Oligonucléotides utilisés pour la mutagenèse dirigée sur le promoteur Nr4a1 IA ... 42 Tableau 2.5. Oligonucléotides utilisés pour l’évaluation préliminaire de la présence de certains ARN
messagers dans les cellules de Leydig ... 44 Tableau 2.6. Résumé des produits pharmacologiques utilisés et de leur concentration utile ... 48
Liste des abbreviations
AC Adénylate Cyclase
ACTH Adenocorticothrophic Hormone AF Activation Function
AHPG Axe Hypothalamo-Pituito-Gonadique Akt Protein kinase B
ALC Adult Leydig Cells AMH Antimullerian Hormone
AMPc Adenosine Monophosphate cyclique
AMPK AMP Kinase
AND Acide désoxyribonucléique ANOVA Analysis of Variance AP-1 Activator Protein 1 ARN Acide Ribonucléique
ATF Activating Transcription Factor bHLH Basic helix-loop-helix
BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bmal1 Brain muscle ARNT-like 1
bZip basic-region leucine-zipper C/EBP CCAAT/enhancer binding proteins CAMK Calmoduline Kinase
CarG Séquences de haute similarité au motif CC[A/T]6GG CBP CREB Binding Protein
CHAPS 3-[(3-CHolamidopropyl)dimethylAmmonio]-1-PropaneSulfonate CHU Centre Hospitalier Universitaire
CHUL Centre Hospitalier Universitaire de l'Université Laval c-JUN Jun Proto-Oncogene
Clock Circadian locomotor output cycles kaput CRE cAMP Response Element
Creb cAMP Response Element Binding Protein
CREB Cyclic Adenosine 3,5-Monophosphate Response Element-Binding Protein
Cyp Cytochrome P450
Dax1 Dosage-sensitive sex reversal, Adrenal hypoplasia critial region, on chromose X, gene 1 (NR0B1)
DBD DNA Binding Domain
Dhh Desert Hedgehog
DHT Dihydrotestosterone
DMEM Dulbeco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide
DTT Dithiothreitol
ECL Enhanced chemilumescent EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EF Helix-loop-helix structural calcium binding domain Egr1 Early Growth Response 1
EPAC Exchange factor directly Activated by cAMP 1
ER Estrogen Receptor
ERK Extracellular signal Regulated Kinase Fgf9 Fibroblast Growth Factor 9
FLC Fœtal Leydig Cells
Fos Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit FSH Folliculostimulatin hormone
Gata4 GATA-binding factor 4
Giot1 Gonadotropin Inducible Ovarian Transcription Factor 1 GnRH Gonadolibérine
GPCR G Protein Coupled Receptor
GRB2 Growth Factor Receptor Bound Protein 2 GTP Guanosine triphosphate
hCG Human Chorionic Gonadotropin HCL Acide Chlorhydrique
Hh Hedgehog
HSD Hydroxysterol déshydrogénase HSP Heat Shock Protein
Insl3 Insulin-like 3 IP3 Inositol Triphosphate
IP3R Récepteur de l'Inositol Triphosphate
JNK Janus Kinase
Jun Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit
kDa Kilodalton
LB Lysogeny Broth
LB Luria-Broth
LBD Liguant Binding Domain
LC/MS/MS Liquid chromatography tandem–mass spectrometry LH Luteinizing Hormone
LHR Luteinizing Hormone Receptor
Lhx9 LIM Homeobox 9
MA-10 Mario Ascoli 10
Maf Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog Mapk Mitogen-activated protein kinase
MARE MAF Recognition Element Mef Myocyte enhancing factor Mln64 Metastatic lym
MLTC-1 Mouse Leydig Tumor Cell 1
NCBI National Center for Biotechnology Information
NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NGFI-B Nerve Growth Factor IB
NIR Nur Important Region
NR Nuclear Receptor
Nrf2 Nuclear factor erythroid 2 (NFE2)-related factor 2 Nur Neurological 77
NurRE Nur Response Element
ORF Open Reading Frame
PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction PDE Phosphodiestérase
Pdgfα Platelet Derived Growth Factor Subunit A
PGC1 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 PI3K Phosphoinositide 3-kinase
PIP2 Phosphatidyl Inositol Diphosphate PKA Proteinte Kinase A
PLC Phospholipase C
PMA Acétate de myristate de phorbol PMCA Plasma Membrane calcium ATPase PTB Polypyrimidine-tract-binding protein RACE Rapid Amplification of cDNA ends Rpl19 Ribosomal protein L19
RPM Révolutions Par Minute RTK Récepteur à Tyrosine Kinase
Rxfp2 Relaxin/Insulin Like Family Peptide Receptor 2 RXFP2 Relaxin family peptide receptor 2
SEM Standard error to the mean
SERCA Sarcoendoplasmic reticular calcium ATPase Sf1 Steroidogenic Factor 1
SH2 Src Homology 2
SMC Site multiple de clonage
Sox SRY-Box
SRC Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src Srebp Sterol regulatory element-binding protein Srf Serum Response Factor
Sry Sex Determining Region Y
STAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein START STAR related Lipid Transfer Proteins
Stat Signal transducer and activator of transcription TAF Tata Assotiated Factor
TBP TATA Binding Protein
TE Tris-EDTA
TFII Transcription Factor II TM4 Mouse Sertoli cell line TM4 T-MARE TRE type Maf Response Element TPA Acétate de Tetradecanoylphorbol TR3 Testicular Orphan Receptor 3 TRE TPA responsive element
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane TSH Thyroid Stimulating Hormone
TSH Thyrothropine TSPO Translocator Protein
Wnt4 Wingless-type MMTV integration site family, member 4
Remerciements
Merci à tous ces gens que j’ai côtoyé au cours des dernières années qui m’ont poussé à finir ce que j’avais commencé. Tout particulièrement, merci à Jacques pour son soutien et son immense générosité envers moi. Un grand merci aussi à Nicholas, Francis, Catherine, Marie-France et tous les autres piliers avec qui j’ai passé de très beaux moments et eu de très stimulantes conversations.
Malgré que ma carrière se soit dirigée hors de la science fondamentale, je garderai toujours un souvenir très précieux du travail de laboratoire, et un profond respect pour les chercheurs et chercheuses qui sont – et demeureront – le moteur le plus puissant de l’avancement des sociétés.
C’est avec beaucoup d’humilité que je dépose ce mémoire et j’espère que les lecteurs y verront un peu de ma curiosité et surtout du désir que j’ai eu de faire ma part pour faire avancer un tant soit peu la connaissance de la biologie moléculaire et cellulaire.
Préface
La souris est un animal très intéressant pour les scientifiques. Le développement embryonnaire est complété en une vingtaine de jours et l’atteinte de l’âge adulte prend à peine plus d’un mois. De bien des façons, cela fait de la souris un modèle physiologique très adéquat. Par ailleurs, les similarités génétiques entre les souris et les humains en font généralement des sujets efficaces pour la prédiction du fonctionnement des processus homologues chez ces derniers. L’exploitation de cellules tumorales provenant de divers tissus ainsi que le développement de techniques permettant l’immortalisation des cellules en culture se sont montrés deux outils indispensables aux chercheurs qui tentent de répondre à la panoplie de questions que soulève chaque jour la vie qui nous entoure. La persévérance et l’ingéniosité de scientifiques passionnés sait faire appel à ces outils et permet chaque jour d’ajouter nombre de détails sur ce tableau du vivant que l’humanité tente de compléter.
Dans cet ouvrage, il sera discuté de la régulation de l’une des pièces du complexe puzzle qu’est la cellule. Cette pièce est membre d’une classe de protéine dont les fonctions et la régulation sont très diversifiés : les récepteurs nucléaires. Leur origine précoce dans l’histoire des métazoaires ainsi que la multitude des membres de la famille qu’ils composent, leur association particulière avec les corégulateurs et la machinerie de modification de la chromatine montrent sans détour que la compréhension de la génétique transcriptionnelle nécessite l’assimilation profonde de leur fonctionnement. Le premier chapitre de cet ouvrage se veut une mise en contexte avec la souris et les différents aspects physiologiques qui sont pertinents pour situer le contenu des chapitres suivants, où seront discutés les aspects touchant le travail que j’ai effectué au cours de ma formation dans le laboratoire du Dr Jacques J. Tremblay.
1. Introduction
1.1. Physiologie développementale
De nombreuses percées dans le domaine de l’évolution du développement ont permis d’éclairer beaucoup de zones grises quant à l’origine et le devenir des différents types cellulaires au cours du développement. Bien que de nombreuses réponses restent incomplètes, certaines autres ont permis de dessiner un portrait bien défini des évènements qui prennent cours durant l’embryogenèse chez la souris.
1.1.1. Développement précoce
Chez la souris, il est généralement reconnu que la première différenciation dans le développement embryonnaire se produit entre le stade 8 cellules et le stade 16 cellules, au quatrième jour de vie embryonnaire. Dans le cas de la souris, cette signalisation, synchronisée par l’augmentation de l’adhésion cellulaire au cours de la compaction de l’embryon au stade 8 cellules, mènera différentes sous-populations dans un nouvel état et une nouvelle identité (1). C’est au cours de ce processus que la liberté de différenciation des cellules est réduite jusqu’à un profil d’expression génique terminal qui définit le tissu.
Au stade de la Morula, les cellules extérieures vont se différencier en trophectoderme, qui deviendra le placenta. Certaines cellules à l’intérieur de l’embryon au stade 8 cellules formeront la masse interne du blastocyste (2). Ces dernières vont par la suite se différencier en deux populations distinctes (3). Cette différenciation prend cours en trois vagues concertées par un processus de classement actine-dépendant, apoptose-dépendant ainsi que position-dépendant, qui définira les cellules de l’épiblaste et de l’endoderme précoce (4). Ceci constitue, selon le consensus actuel, l’un des points déterminants de l’organisation axiale de l’embryon. Les cellules de l’épiblaste prendront la direction de l’ectoderme, duquel découlent les autres feuillets des animaux triploblastiques, tandis que les cellules de l’endoderme précoce participeront à la formation des structures extra embryonnaires avec les cellules du trophectoderme (4).
1.1.2. Le développement de la gonade
Les gonades sont issues de la crête gonadique, qui elle-même origine du mésoderme. Les cellules germinales primordiales sont d’origine épiblastique et sont déjà identifiables au moment de la gastrulation (5). Ces dernières vont émigrer de façon complexe via certaines structures extra-embryonnaires, pour finalement rejoindre la crête gonadique via le mésentère dorsal juxtaposé à la paroi de l’endoderme de l’intestin postérieur (6, 7). Chez les mammifères, la gonade est, jusqu’à ce point, indiscernable entre les deux sexes et
subit une morphogenèse précoce en vue de la détermination sexuelle. Ce processus est régulé par certains gènes dont l’invalidation conduit à l’agénésie gonadique, malgré une visible colonisation de la crête gonadique par les cellules germinales primordiales. Par exemple, l’invalidation de LIM homeobox protein 9 (Lhx9) cause l’arrêt dans le développement tandis que celle de Wilms’ tumor 1 (Wt1) ou de Steroidogenic factor 1 (Sf1) cause la dégénérescence par apoptose de l’ébauche gonadique (8-11). En l’absence de défaut du métabolisme, la gonade jusqu’alors bipotentielle va s’engager dans l’une ou l’autre des directions, ovaire ou testicule, selon le décor génétique fourni par le chromosome sexuel d’origine paternelle (12).
1.1.3. La détermination sexuelle
Il aura fallu près de soixante-dix ans après la découverte des chromosomes sexuels chez les mammifères pour trouver le gène responsable de la détermination sexuelle mâle. En fait, près de 40 ans se sont écoulés avant de lier les chromosomes sexuels avec le développement du phénotype correspondant. Ce n’est qu’en 1990 que le gène Sex-determining region Y (Sry) a été découvert par deux groupes indépendants, dont le travail a mis en évidence la relation entre l’expression de Sry et l’apparition des cellules de Sertoli. L’étude du gène Sry est complexe en raison de la diversité des mécanismes de détermination sexuelle dans le royaume animal. En effet, ce gène n’est présent que chez les mammifères et l’homologie au sein de ce groupe n’est que limitée. Il n’en reste pas moins que la présence de Sry est responsable de l’apparition du phénotype mâle chez les mammifères (13, 14). Cette découverte a pendant un certain temps alimenté l’idée selon laquelle le processus de détermination féminin serait le programme par défaut du développement humain (15), une vision qui s’est avérée erronée avec la découverte du gène Dax1 (Nr0b1), dont la duplication chez un individu XY cause une réversion sexuelle complète (16). Par ailleurs, la découverte de Dax1 a permis de mettre en évidence l’existence de processus actifs pour l’apparition et le maintien des caractères femelles (17). Ces découvertes ont su ébranler les paradigmes de la biologie du développement, permettant de paver la voie vers la découverte des processus moléculaires d’antagonisme entre les déterminants sexuels mâles et femelles. Les acteurs les plus précoces et les plus importants de cet antagonisme sont Sry/Sox9 (18, 19) chez le mâle et Wnt/β-catenin (20) chez la femelle. Ces derniers vont entrer, pour reprendre les termes du chercheur David Zarkower, dans une « course à la primauté » pour instituer le réseau de régulateurs qui dirigera le développement de la gonade et, vraisemblablement, le maintien de son état de différenciation tout au long de la vie (21).
La série d’évènements qui suit l’expression du gène Sry va mener à la différenciation séquentielle des deux types de cellules de soutien aux cellules germinales mâles. Les cellules de Sertoli sont les premières différenciées suite à l’expression de Sox9 induite par Sry (22). Ces dernières proviennent vraisemblablement
de l’épithélium cœlomique, qui contribuera aussi à la formation du tissu interstitiel de la gonade. Les cellules de Leydig se différencient ensuite, probablement en réponse aux protéines Desert Hedgehog (DHH) et PDGF-A produites par les cellules de Sertoli (23). L’origine des cellules de Leydig fœtales est longtemps restée mystérieuse, avec comme probables candidats des cellules mésenchymateuses issues soit du mésonéphros, de la crête neuronale, de l’épithélium cœlomique ou encore des cellules péritubulaires (24). Certaines évidences, basées notamment sur le profil enzymatique ainsi que sur l’expression du gène Sf1, semblent pointer vers une origine commune avec les cellules de la surrénale, ce qui suggère une migration de certaines cellules du mésonéphros vers la crête gonadique avant le onzième jour embryonnaire (25, 26). D’élégants travaux effectués dans le laboratoire de Blanche Capel à Duke University ont mis en évidence la non-exclusivité de ces hypothèses en suivant le devenir des cellules de chacun de ces deux compartiments avec certains marqueurs cellulaires, dont certains membres de la famille MAF qui sera décrite dans les sections subséquentes (27). Il en découle que les cellules de Leydig fœtales chez la souris ont effectivement une double origine, bien que les conséquences physiologiques de cette origine soient pour l’instant inconnues. La mise en place de ces deux populations de cellules somatiques finalise le contexte de la détermination masculine et regroupe tous les éléments nécessaires à la différenciation sexuelle masculine.
1.1.4. La différenciation sexuelle masculine
La différenciation sexuelle est un processus largement régulé de façon endocrine. Trois hormones sont nécessaires à la mise en place des organes génitaux mâles sans lesquelles les individus présenteront certains troubles du développement pouvant mener à l’ambigüité sexuelle. Ces trois hormones sont l’hormone antimüllérienne (AMH), la testostérone et Insulin-like 3 (INSL3). Ces hormones vont agir de façon séquentielle afin de causer la dégénérescence des structures du système reproducteur féminin tout en permettant le développement des structures mâles chez les individus XY.
L’AMH est une hormone peptidique sécrétée par les cellules de Sertoli et l’expression du gène Amh est sous l’influence de certains facteurs tels SOX8, SOX9, SF1, WT1, DAX1 et GATA4 (28-33). Sa sécrétion engendre la dégénérescence rapide des canaux de Müller via deux récepteurs transmembranaires sur les cellules cibles (34). Chez les souris, l’invalidation du gène de l’Amh ou celle de ses deux récepteurs a comme effet le maintien de certaines structures du système reproducteur féminin, sans empêcher la production de spermatozoïdes viables. Ces souris sont cependant infertiles à cause d’un mauvais transit de l’éjaculat lors du coït (35). Chez l’humain, les conséquences de mutations dans le gène de l’hormone antimüllérienne sont plus sévères et peuvent mener à certaines malformations de l’appareil génital masculin. On retrouve cependant, comme chez la souris, la persistance de structures dérivées des canaux de Müller (36).
INSL3 est une hormone nécessaire à la descente du testicule. Cette hormone est sécrétée tout au long de la vie par les cellules de Leydig et va contribuer, dans un premier temps, à la phase transabdominale de la descente testiculaire et, dans un deuxième temps, au maintien de la santé osseuse chez les mâles (37). Le rôle de INSL3 a été élucidé par l’étude de souris invalidées pour ce gène, où l’on observe la non descente bilatérale des testicules (38, 39). À cet effet, il convient de mentionner qu’il été cru pendant la meilleure partie d’une décennie qu’INSL3 était aussi nécessaire à la survie des cellules germinales chez l’adulte, ce qui a éventuellement été démenti par l’obtention d’un délétant conditionnel pour le gène du récepteur d’INSL3 (Rxfp2) chez qui la fonction testiculaire était normale (40).
La testostérone est la troisième hormone nécessaire à la différenciation du système génital mâle. Dans ce contexte, la testostérone est nécessaire au développement des canaux de Wolff ainsi qu’à la seconde partie de la descente testiculaire (37), ce qui explique la non-descente des testicules chez les individus souffrant d’une insensibilité aux androgènes due à une mutation chez le récepteur aux androgènes.
Au niveau des organes génitaux externes, la testostérone sera réduite en dihydrotestostérone (DHT) par la 5α réductase et permettra la complétion du développement en permettant notamment la fermeture du scrotum et l’élongation du pénis (41).
1.1.5. Les cellules de Leydig
Chez la plupart des mammifères, deux populations de cellules de Leydig distinctes vont apparaître au cours de la vie. Essentielles à la virilisation du fœtus, les cellules de Leydig fœtales (FLC) vont disparaître à la naissance de la progéniture, pour être remplacées au cours de l’enfance par la population de cellules de Leydig adultes (ALC). Ces dernières seront responsables du déclenchement de la puberté. Les détails de ces deux populations sont discutés aux sections suivantes.
1.1.5.1. Les cellules de Leydig Fœtales
Chez la souris, les FLC apparaissent environ 24 heures après les cellules de Sertoli, soit au jour embryonnaire 12.5 (13). Malgré les incertitudes qui persistent quant à leur origine, il est accepté que les cellules de Leydig proviennent de cellules négatives pour la présence de Sox9/Sry, impliquant ainsi l’existence d’un signal provenant des cellules de Sertoli pour induire leur différenciation (27, 42). Cette inférence provient en partie du fait que les cellules de Leydig, à ce stade, sont incapables de mitose, mais qu’une augmentation substantielle
de leur nombre survient entre le jour embryonnaire 12.5 et 15.5 (43, 44). Parmi plusieurs candidats pour le rôle de signal de différenciation des cellules de Leydig, le gène Hedgehog (Hh) semble être particulièrement intéressant. En effet, l’expression forcée de Hh dans les cellules positives pour SF1 dans l’ovaire fœtal induit la différenciation de cellules de Leydig fœtales capables de sécréter des androgènes ainsi que INSL3, menant à la masculinisation de ces modèles de souris femelles (45). Plusieurs autres gènes semblent importants pour la différenciation des cellules positives pour SF1 en cellules de Leydig fœtales et il n’est pas toujours évident de déterminer la causalité du phénotype observé chez les modèles de souris invalidés pour l’un ou l’autre de ces gènes (24, 42). Il reste que la présence des cellules de Leydig fœtales est nécessaire à la différenciation de l’appareil génial masculin, qui dépend de la présence d’androgènes (46-48).
Chez la souris, la production d’androgènes par les cellules de Leydig fœtales semble indépendante à la présence d’hormone lutéinisante, ce qui n’est pas le cas chez les humains. Par contre, il a été déterminé que chez ces deux espèces, la présence d’ACTH va pouvoir moduler la stéroïdogenèse, ce qui pointe vers une origine commune des cellules de Leydig fœtales avec les cellules de la crête du mésonéphros (26, 49, 50). À cet égard, il est pertinent de mentionner qu’une équipe de recherche a pu montrer que les cellules de Leydig fœtales étaient en mesure de produire une certaine quantité de corticostérone en réponse à la hCG ainsi qu’à l’ACTH (26). Ceci vient par ailleurs appuyer les évidences mentionnées précédemment quant à une potentielle migration de cellules du mésonéphros vers la crête gonadique avant le jour embryonnaire 10.5 chez la souris.
Il est reconnu que la première fonction des cellules de Leydig fœtales est de produire des androgènes. Chez la souris, cette fonction débute aux environs du 13e jour de gestation et se poursuit jusqu’à la naissance (51), où la dégénérescence de la population fœtale de cellules de Leydig entraîne la fin de la production d’androgènes et ce, jusqu’à la puberté (26). Inversement, l’absence d’androgènes ou l’insensibilité aux androgènes dans le développement fœtal mène à un pseudohermaphrodisme avec dégénérescence des structures masculines internes comme les canaux de Wolff (52, 53). Chez la souris, les cellules de Leydig fœtales ne semblent pas exprimer l’enzyme 17BHSD, ce qui limite leur production d’androgènes actifs. En effet, le produit principal semble être l’androstène delta-4-dione, qui serait subséquemment transformé en testostérone par les cellules de Sertoli (25, 54).
Si les cellules de Sertoli, par l’activation de la voie Sox9/SRY, sont capables à elles seules d’orchestrer l’organisation de l’ébauche gonadique, la complexification de la structure embryonnaire du testicule en vient à impliquer de nombreux autres signaux qui sont nécessaires pour la complétion du développement de la gonade. À ce sujet, la deuxième fonction des cellules de Leydig est la sécrétion d’INSL3, une hormone
peptidique dont la fonction dans le système reproducteur est d’assurer la première phase de la descente testiculaire. En effet, cette question a été résolue par l’inactivation ciblée d’INSL3 ainsi que de son récepteur RXFP2, qui résultent en une cryptorchidie bilatérale complète (38, 55). Finalement, la présence de testostérone étant absolument nécessaire à la seconde phase de la descente testiculaire, il est possible de déduire que les cellules de Leydig sont essentielles non seulement à l’externalisation du testicule, mais aussi à la finalisation des structures associées comme le scrotum, qui recevra le testicule descendu (56, 57).
1.1.5.2. Les cellules de Leydig Adultes
Les cellules de Leydig adultes sont un modèle beaucoup plus étudié que les cellules de Leydig fœtales. D’un point de vue pratique, les cellules de Leydig sont peu nombreuses et leur enrichissement difficile, ce qui fait que les testicules adultes sont beaucoup plus faciles à utiliser que les testicules fœtaux, simplement à cause de leur taille. En effet, quelques lignées cellulaires tumorales de souris et de rat sont disponibles, ce qui permet l’étude de certains processus qui, autrement, seraient restés dans l’ombre.
Les cellules de Leydig, chez les mâles adultes, sont la source principale de stéroïdes sexuels avec comme produit principal la testostérone (58). Tout comme les cellules de Leydig fœtales, l’origine des cellules de Leydig adultes reste incertaine (59). Il est cependant accepté qu’elles ne proviendraient pas de la population de cellules de Leydig fœtales mais d’une population de cellules souches interstitielles qui se maintiendrait au cours de l’enfance jusqu’à la puberté (59, 60). À ce moment, une sous-population de ces cellules entrera dans un processus de différenciation en trois étapes vers les cellules de Leydig adultes avec la participation de certains des mêmes acteurs que pour la différenciation des cellules de Leydig fœtales (par exemple : DHH et PDGF-A) (59-62). La première étape constitue en la formation des cellules progénitrices, reconnaissables par l’expression des gènes codant pour des enzymes stéroïdogéniques et par la présence d’une forme inactive du récepteur de la LH (59, 60). Ces cellules vont ensuite avancer dans le processus de différenciation en réponse à plusieurs signaux, dont la présence d’androgènes, en cellules immatures. Ces cellules ont une fonction stéroïdogénique active, mais limitée à la production de 3-diol (63). En effet, la présence d’une forte expression de 5 réductase, dont l’affinité envers le delta4 -dione est élevée, ne permet pas la formation de testostérone, mais détourne plutôt l’équilibre de la chaine métabolique vers la production de 3-diol (63). C’est uniquement plus tard, avec une augmentation de la présence du récepteur de la LH non-tronqué et fonctionnel, que l’expression de la 5 réductase sera réduite et permettra à la 17BHSD d’utiliser le delta4 -dione comme substrat et, ainsi, aux cellules de Leydig adultes de produire la testostérone comme androgène principal (63). Ceci permettra la virilisation adéquate des individus à la puberté, le maintien des
caractéristiques sexuelles secondaires mâles au cours de la vie adulte, et l’initiation et le maintien de la spermatogenèse.
1.1.6. Les cellules de Sertoli
Tel que mentionné précédemment, les cellules de Sertoli sont les premières cellules à être différenciées suite à l’expression de Sry dans l’ébauche gonadique (22). La production de souris chimériques composées de cellules XX et XY a permis de mettre en évidence une forte corrélation entre la présence du chromosome Y et la capacité de cellules de la gonade non-différenciée à se transformer en cellules de Sertoli (64). Cette corrélation a par la suite été expliquée par l’expression de Sry qui est limitée à la population de cellule vouée à devenir les cellules de Sertoli (18, 65, 66). Le rôle de la protéine SRY est donc d’amplifier l’expression du gène Sox9 qui est la pièce angulaire de la détermination sexuelle, dans un processus nommé décision cellulaire autonome (cell autonomous decision) (67). Une série d’expérience a par ailleurs suggéré que l’augmentation de l’expression de Sox9 peut à elle seule faire pencher l’équilibre de la détermination sexuelle vers le phénotype mâle.
Suite à l’initiation de l’expression de Sox9 par SRY, certains autres signaux paracrines ont été démontrés comme important pour l’établissement et le maintien de l’expression de Sox9. Le principal de ces facteurs est Fgf9, impliqué dans une boucle de rétroaction positive avec Sox9 qui sera responsable de l’inhibition de l’expression de Wnt4, dans une dynamique brièvement mentionnée précédemment. Un élégant résumé de cette interaction et de la série d’expériences qui ont mené à la compréhension de cette dynamique d’expression génique a été publié en 2008 par Maatouk et Capel de Duke University (68).
La décision cellulaire autonome des cellules progénitrices des cellules de Sertoli constitue un évènement clé pour la formation éventuelle des tubules séminifères, la prévention de l’entrée précoce des cellules germinales en méiose ainsi que la différenciation des cellules de Leydig (69). Pendant la vie fœtale, les cellules de Sertoli sont directement impliquées dans la différenciation sexuelle via la production de l’hormone antimüllérienne, qui sera sécrétée par les mammifères mâles jusqu’à la puberté (69, 70). Suite à la complétion de la différenciation sexuelle, les cellules de Sertoli progresseront pour avoir un rôle pivot dans la spermatogenèse. En effet, les cellules de Sertoli permettent la différenciation et la méiose des cellules germinales, en plus de soutenir leur transformation finale en spermatozoïdes (71). Il existe à ce propos une association directe entre la quantité de cellules de Sertoli différenciées et l’envergure de la production de spermatozoïdes (72). Contrairement aux cellules de Leydig, les rôles des cellules de Sertoli d’âge adulte ne sont pas associés à deux populations distinctes de cellules, mais bien à un processus de différenciation ayant lieu lors de la puberté. Cette
différenciation, ou maturation, donne lieu à divers changements morphologiques et fonctionnels, dont les principaux sont la perte de la capacité de prolifération (brièvement mentionnée aux paragraphes suivants) ainsi que l’apparition de jonctions serrées entre les cellules de Sertoli adjacentes (73). Ceci prend toute son importance sachant qu’il existe vraisemblablement une association entre la dysgénésie testiculaire et le développement et la prolifération des cellules de Sertoli immatures (74, 75).
Chez tous les mammifères, les cellules de Sertoli immatures sont capables de prolifération. Cette prolifération se produit dans la période fœtale et néonatale ainsi qu’au moment de la puberté. L’importance relative de ces deux périodes varie et peut même, chez certaines espèces comme les rongeurs, se chevaucher (73). Dans tous les cas, la quantité totale de cellules de Sertoli, et par association, la quantité totale de cellules germinales, est déterminée de façon permanente avant l’âge adulte.
Chez le rat, la prolifération des cellules de Sertoli semble être sous le contrôle hormonal de plusieurs facteurs dont les principaux sont l’hormone folliculostimulante (FSH) et les hormones thyroïdiennes (73). En effet, l’inhibition de la sécrétion de FSH dans la période néonatale chez les rats cause une diminution de près de 40% du nombre de cellules de Sertoli, tandis qu’une augmentation par injection de la FSH produit une augmentation de 18 à 49% du nombre de cellules de Sertoli. Inversement, l’induction d’hypothyroïdie néonatale cause une augmentation marquée de 82 à 157% du nombre de cellules de Sertoli tandis que l’induction d’hyperthyroïdie réduit le nombre de cellules de Sertoli de près de 50% (73). Ces deux expériences influencent vraisemblablement la quantité finale de cellules de Sertoli en contrôlant l’âge auquel leur prolifération achève et, par association, l’âge auquel leur maturation prend cours (76-78).
Finalement, le rôle des cellules de Sertoli pendant le développement fœtal inclut aussi d’induire la différenciation des FLC, via la production et la sécrétion de facteurs spécifiques. Entre autres, DHH et PDGF-A sont tous deux des facteurs nécessaires à cette différenciation, causant des phénotypes de pseudohermaphrodisme avec des organes génitaux extérieurs féminisés chez les souris pour lesquelles ces leurs gènes respectifs ont été invalidés (9, 79, 80).
1.2.
L’endocrinologie de la gonade
Le terme hormone (du grec pour susciter, exciter) a été utilisé la première fois il y a maintenant plus de cent ans pour décrire les effets des sécrétions pancréatiques sur l’organisme. Ce terme a par la suite été généralisé pour décrire les effets de tous les produits sécrétés par les glandes (81). Les hormones étant les messagers de l’organisme, il est facile de comprendre que le domaine de l’endocrinologie a été – et est
encore – un domaine fascinant, dans lequel les retombées sont d’une importance capitale pour la compréhension de l’organisation des êtres vivants. Une des grandes percées du 20e siècle en physiologie a été l’identification des récepteurs correspondant aux nombreuses hormones qui avaient déjà été identifiées depuis les années 1920. Il était connu que ces hormones, dont un bon nombre de molécules stéroïdiennes, avaient une fonction spécifique à certains tissus, mais le mécanisme d’action par lequel ces hormones exerçaient leur fonction était à l’époque inconnu. Les premières études sur la mécanistique de la signalisation hormonale s’attendaient d’ailleurs à trouver un mécanisme universel à toutes les hormones, reposant sur l’interaction directe de l’hormone avec les protéines. Cette affirmation s’est rapidement révélée erronée et la communauté scientifique a affiné sa vision de l’endocrinologie au fur et à mesure que divers acteurs, dont notamment l’AMPc, ont été découverts (81).
D’un point de vue historique, le progrès de la littérature et les vibrants débats ayant eu lieu entre les divers acteurs de la recherche académique de l’époque a donné naissance à bon nombre de modèles qui semblent aujourd’hui sortir de l’ordinaire. Cette effervescence n’est pas sans rappeler les années 1940 et la structure de la double hélice (82). Un regard rétroactif sur ces épisodes nous laisse, comme scientifiques, un émerveillement quant à la créativité dont notre communauté peut faire preuve lorsque la compétition s’empare des passions!
Une étape critique de la compréhension moderne de l’endocrinologie a été permise par la découverte, le clonage et la caractérisation des récepteurs (81). À l’heure actuelle, il reste vraisemblablement peu de nouvelles familles de candidats à ajouter à la collection déjà connue de ces molécules, du moins chez l’être humain. Ceci n’en fait pas un domaine de recherche stérile, au contraire, puisque la complexité des interactions que l’on observe in vivo, communément appelée communication croisée (crosstalk), a ouvert un vaste horizon sur la subtilité de la signalisation intracellulaire (83).
La découverte presque simultanée de bon nombre de seconds messagers associés à la surface cellulaire, ainsi que d’hormones exerçant leur effet en modifiant l’expression génique a mené rapidement à une première classification des récepteurs : ceux existant dans la membrane plasmique, les autres semblants de situer au noyau. Ces derniers ont par la suite été classés en plusieurs familles, d’abord selon leur localisation, ensuite en fonction du type de réponse qu’ils entraînent (81).
Puisqu’une revue en détails de toutes les classes de récepteurs qui ont été découvertes dépasse la portée de ce document, la discussion suivante se limitera à la description de trois classes de récepteurs, soient les
récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs à tyrosine kinase et enfin, les récepteurs nucléaires. Entre eux, il est raisonnable de dire qu’ils se partagent la régulation de certains des processus physiologiques les plus importants, tant pour la réponse topique à certains stimulus que pour les réponses chroniques, telles le stress ou l’état de différenciation.
En premier lieu, il convient de positionner le lecteur en survolant l’une des boucles de rétroaction les plus étudiées chez les mammifères : L’axe hypothalamo-pituito-gonadique. Cet axe est brièvement décrit à la section suivante.
1.2.1.
L’axe hypothalamo-pituito-gonadique
L’axe hypothalamo-pituito-gonadique (AHPG) est primordial dans la production des hormones sexuelles. L’hypothalamus, à partir de la maturité sexuelle, produit la gonadolibérine (GnRH). La sécrétion de gonadolibérine se fait de façon pulsatile, en réponse à une diminution de la quantité de testostérone circulante ainsi qu’à une variété d’autres facteurs activateurs, tels la leptine et l’insuline, ou inhibiteurs, tel que la grhéline (84). La gonadolibérine (GnRH) est une hormone peptidique se fixant à un récepteur membranaire au niveau de la glande pituitaire antérieure (85, 86). En réponse à ce signal, les cellules de la glande pituitaire antérieure produisent la LH et la FSH, dont le rôle est de stimuler la maturation et la fonction du testicule et de l’ovaire, ainsi que de réguler la gamétogenèse et la stéroïdogenèse (87). Les effets de la FSH ne seront pas abordés en profondeur dans le cadre de cette dissertation.
Les deux hormones, LH et FSH, ont des rôles et des sites d’actions différents dans les testicules et contribuent chacune à leur façon à la spermatogenèse (88). Dans les deux cas, l’action des hormones gonadotropiques sur la spermatogenèse se fait de façon indirecte, via leur effet sur les cellules de soutien du testicule (89). La FSH agit sur les cellules de Sertoli en activant les voies de signalisation nécessaire à la maturation des cellules germinales (90). La LH agit sur les cellules de Leydig en se fixant à son récepteur LHR et active les voies de signalisation nécessaires à la production de testostérone. Entre autres, la testostérone agira sur les cellules de Sertoli et les autres cellules du testicule et est l’hormone tropique principale impliquée dans la spermatogenèse sécrétée par les cellules de Leydig (91). Par ailleurs, la testostérone est aussi nécessaire à la masculinisation des mâles et, éventuellement, au maintien des caractéristiques sexuelles secondaires mâles (89). Malgré que la testostérone seule soit capable de maintenir la fertilité chez les mâles en absence de glande pituitaire, il est généralement reconnu qu’une panoplie d’autre facteurs sont importants pour le maintien de la fertilité chez les mâles (89).
La boucle de rétroaction qui donne son nom à l’AHPG est responsable de l’homéostasie endocrinienne de la testostérone. D’autres boucles semblables existent pour la régulation de la production des glucocorticoïdes ainsi que des hormones thyroïdiennes (92). La régulation de la stéroïdogenèse par l’AHPG implique une dynamique d’activation et d’inhibition par plusieurs acteurs dont les éléments les plus connus sont résumés à la Figure 1.1.
La LH produit son action au niveau des cellules de Leydig et résulte en une augmentation de la quantité circulante de testostérone. Chez la souris, cette augmentation a vraisemblablement un effet direct sur l’hypothalamus et la glande pituitaire antérieure quant à leur capacité respective de sécrétion et de réponse à une stimulation par la gonadolibérine (93-95). Ceci diffère du modèle classique suggérant un effet indirect de la testostérone sur la glande pituitaire antérieure et l’hypothalamus via l’aromatisation en estrogène (96, 97). Ce même mécanisme serait cependant responsable de la régulation de la prolactine chez les mâles (93, 95).
En demeure que la concentration de testostérone régule négativement et de façon dose dépendante la sécrétion de la LH par la glande pituitaire antérieure. Cette diminution réduit la stimulation des cellules de Leydig via le LHR, ce qui entraîne une diminution de la production de testostérone. Conséquemment, la production de LH augmente de nouveau, conduisant un nouveau cycle d’activation-rétroaction.
L’activine, l’inhibine et la follistatine sont aussi des éléments importants de la régulation de la sécrétion de gonadotropines. L’inhibine est principalement sécrétée au niveau des cellules de Sertoli en réponse à une stimulation par la FSH et cause une rétroaction négative au niveau de la sécrétion de cette dernière par la glande pituitaire antérieure, sans affecter la production de gonadolibérine ni de LH (98). L’activine est sécrétée par plusieurs tissus dont ceux du testicule (incluant les cellules de Sertoli, les cellules de Leydig, les cellules péritubulaires, ainsi que les cellules germinales). Une exposition des cellules de Sertoli à la FSH inhibe la sécrétion d’activine (89). L’activine a des effets divers et, contrairement à l’inhibine, elle agit majoritairement de façon paracrine et autocrine via ses différents récepteurs (98). Au niveau de la gonade, l’activine agit vraisemblablement en potentialisant l’effet des gonadotropines sur ses tissus cibles. Au niveau de la glande pituitaire, elle est sécrétée par les cellules gonadotropes et contribue à augmenter la sécrétion de FSH (98). L’inhibine peut aussi entrer en compétition pour les mêmes sites de liaisons que l’activine, modulant ainsi son effet (89). Enfin, la folliculostatine est capable de lier l’activine avec une grande affinité et permet ainsi d’en empêcher l’effet, notamment sur la glande pituitaire antérieure (99).
Figure 1.1. Représentation de l’axe hypothalamo-pituito-gonadique.
Les flèches vertes représentent une stimulation. Les flèches rouges représentent une inhibition. L’hypothalamus libère la gonadolibérine (GnRH) qui stimule la sécrétion de l’hormone folliculostimulante (FSH) et de l’hormone lutéinisante (LH) par la glande pituitaire antérieure. L’activine agit en synergie avec les gonadotropines au niveau des gonades et active la sécrétion de FSH au niveau de la glande pituitaire antérieure. La LH et la FSH vont, respectivement, activer la
spermatogenèse et la stéroïdogenèse. En réponse à cette stimulation, les cellules de Sertoli vont sécréter l’inhibine et la folliculostatine qui vont respectivement inhiber la sécrétion de FSH et séquestrer l’activine pour en empêcher les effets. La testostérone inhibe directement la sécrétion de GnRH par l’hypothalamus et réduit la capacité de réponse à la GnRH de la glande pituitaire antérieure.
La production des hormones de l’AHPG obéit à une pulsatilité qui varie au cours de la journée et en fonction de l’âge ou de la condition physique des sujets. En effet, on observe chez les adolescents mâles une forte augmentation de la sécrétion de LH pendant la nuit, suivie d’une augmentation de la testostérone sérique dans les premières heures de la journée (100, 101). Ce profil est conservé au cours de la vie adulte, quoique les variations quotidiennes deviennent moins intenses avec l’avancement en âge (101). Malgré cette progression, le rôle de la LH restera central au maintien des caractéristiques sexuelles mâles tout au long de la vie.
Tel que mentionné précédemment, la sécrétion de LH est intimement liée à la stéroïdogenèse, tant chez les mâles que les femelles. Cette hormone fait partie de la famille des glycoprotéines, avec la hCG, la FSH et la thyrotropine (TSH). Toutes les glycoprotéines pituitaires sont constituées d’une sous-unité alpha commune, avec laquelle doit se dimériser de façon obligatoire une sous-unité beta qui va conférer à l’hétérodimère sa spécificité (87). Les glycoprotéines étant des molécules de grande taille, hautement hydrophiles, elles agissent en surface des cellules sur une classe de récepteur membranaire qui sera décrite aux paragraphes suivants.
1.2.2. Les récepteurs couplés aux protéines G
Le récepteur de la LH, comme ceux des autres glycoprotéines, est de la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Il s’agit d’une classe très répandue de protéines dont la répartition dans l’arbre du vivant est pratiquement ubiquitaire. Ceux-ci sont responsables de processus multiples et complexes et les médicaments qui les ciblent représentent actuellement près de 50% des revenus des compagnies pharmaceutiques (102). À l’heure actuelle, on compte de 800 à 950 récepteurs couplés aux protéines G chez les humains (103-105). Pour ajouter à cette complexité, les récepteurs liés aux protéines G peuvent agir seuls ou en multimères. L’organisation de ces multimères et de leurs protéines G associées sont entre autres responsables de la diversité et de la spécificité des réponses induites. Ainsi, une même hormone peut avoir un large spectre d’effets tissu-dépendants (106).
Les GPCR sont répartis en cinq classes ne partageant que peu d’homologies entre elles (107). La première de ces classes (A) regroupe les récepteurs à la rhodopsine et possède plus de membres que toutes les autres familles réunies (105). La classe B regroupe les récepteurs couplés aux protéines G principalement régulés par les hormones peptidiques membres de la famille du glucagon et de la sécrétine (108, 109). Les récepteurs de la classe C et D ne sont pas retrouvés chez les vertébrés, mais plutôt chez les mycètes et myxomycètes, où ils sont impliqués dans la reproduction sexuée, la détection des phéromones (110) et la réponse à l’AMPc (111). Enfin, la classe F regroupe les récepteurs des familles Frizzled et Smoothened, importants dans la signalisation par WNT et HH et impliqués notamment dans la différenciation cellulaire (112, 113).
Tous les récepteurs couplés aux protéines G partagent certaines caractéristiques à commencer par leur disposition spatiale dans la cellule. Ils possèdent tous une partie N-terminale extracellulaire suivie de sept domaines transmembranaires. Les récepteurs couplés aux protéines G ont un domaine cytosolique C-terminal court, dont la fonction est principalement d’interagir avec les protéines G (103).
Les protéines G sont des protéines possédant trois sous-unités et qui font partie d’une famille comprenant beaucoup moins de membres que les récepteurs qui leur sont couplés. On compte actuellement 21 sous-unités Gα (16 gènes distincts), 6 sous-sous-unités Gβ (5 gènes distincts) et 12 sous-sous-unités Gγ (114). Les sous unités Gα possèdent une fonction GTPase dont la fonction est de permettre la terminaison de la signalisation et le retour de la protéine G à son facteur d’échange de guanosine (115). Le processus d’activation de la sous-unité Gα par le récepteur implique la formation d’un complexe avec la queue C-terminale du récepteur. Ce processus est encore un domaine d’étude très actif (114). La sous-unité Gβγ est aussi impliquée dans la signalisation cellulaire et son rôle principal, tel que décrit dans les exemples classiques de la littérature, est
l’activation de la phospholipase C. Cette enzyme a la fonction d’hydrolyser le phosphatidyl inositol diphosphate (PIP2) en inositol triphosphate (IP3) et dyacylglycérol (DAG) (116). La sous-unité Gα des protéines G agit classiquement sur l’adénylate cyclase et favorise ou inhibe la formation d’AMPc, un second messager très important dans la cellule (115). Il convient cependant de mentionner que ces rôles ne sont pas mutuellement exclusifs. La fonction de ces seconds messagers sera abordée ultérieurement. Parmi les caractéristiques des processus que ces deux seconds messagers vont faciliter, il convient de mentionner l’importance toute particulière du calcium et de l’AMPc dans l’activation de kinases nécessaires au changement de l’expression des gènes.
1.2.3. Les récepteurs à tyrosine kinase
Les récepteurs à tyrosine kinase (RTK) sont une autre classe de récepteurs importants pour plusieurs processus cellulaires. Chez les humains, 58 RTK ont été décrits, appartenant à 20 familles (117). Les RTK partagent tous une structure commune comprenant un domaine extracellulaire ayant la capacité de lier un ligand, une hélice α transmembranaire ainsi qu’une région cytoplasmique plus complexe contenant le domaine tyrosine kinase. Enfin la partie cytosolique comprend aussi une région juxtamembranaire et carboxyterminale, dont le rôle est important dans l’autoinhibition de la réponse hormonale des RTK (117). Les RTK sont impliqués dans la réponse aux hormones de croissance (118). Généralement, la liaison d’un ligand sur le domaine extracellulaire résulte en la dimérisation de deux récepteurs. Le changement de conformation de la partie cytosolique des RTK résultant de la liaison du ligand va activer la fonction tyrosine kinase. Plus précisément, c’est l’élimination de la cis-inhibition du couple RTK qui permettra l’activation du récepteur (117). Les résidus tyrosine phosphorylés en réponse vont ensuite servir d’échafaudage pour l’assemblement de protéines de signalisation (118).
L’autophosphorylation des RTK va permettre la liaison de protéines contenant des domaines de reconnaissance SH2 ou PTB, qui vont se lier aux résidus tyrosine phosphorylés. Ces protéines possèdent aussi des sites tyrosines pouvant être phosphorylés et serviront en retour à accueillir une panoplie de seconds messagers dont PI3K et GRB2 (117).
Dans les cellules de Leydig, et plus particulièrement dans la régulation de l’expression de Nr4a1, l’importance PI3K et GRB2 a été décrite, notamment à cause de leur implication dans l’activation de la voie ERK et Akt, respectivement (119-121). Par ailleurs, l’importance de ces deux voies dans la stéroïdogenèse et la fertilité a aussi été documentée (122-124).
Une description plus en détails de cette classe de récepteurs dépasse le cadre de cette discussion mais l’intérêt scientifique demeure, avec plus de 911 études cliniques répertoriées sur ClinicalTrials.gov et qui étudient l’importance des RTK dans différentes pathologies.
1.2.4.
La réponse à l’hormone lutéinisante
La reproduction chez les mammifères est dépendante de nombreux signaux. Parmi ceux-ci, la sécrétion pulsatile de LH et de FSH a un rôle clé dans la régulation de la fonction gonadique. Dans le testicule, la LH agit via un récepteur membranaire sur la surface des cellules de Leydig. Le récepteur de la LH (LHR), via ses médiateurs intracellulaire, est responsable, entre autres, du maintien des processus métaboliques liés à la stéroïdogenèse (87). Il convient à ce moment de la dissertation de mentionner que l’hormone chorionique gonadotropique (hCG), similaire à la LH mais produite par le placenta lors de la grossesse, est couramment utilisée en laboratoire car elle possède plusieurs caractéristiques qui la rendent plus pratiques que la LH. Entre-autres, sa capacité de lier avec haute affinité le récepteur de la LH, sa stabilité et son abondance relative (87). Dans le cadre de cet essai, l’effet de la LH sur les cellules de Leydig sera considéré équivalent à celui de la hCG. Ainsi, l’une comme l’autre sera utilisée de façon interchangeable, bien que certaines évidences récentes ont démontré l’existence d’un biais pour l’une ou l’autre des possibles voies de signalisation en aval du récepteur, en fonction du ligand utilisé (125).
La liaison de la LH cause un changement de conformation du récepteur qui entraîne l’activation de la protéine G hétérotrimérique qui lui est associée. Cette activation induit ensuite l’activation de multiples voies de signalisation qui seront décrites aux paragraphes suivants.
Il est bien établi dans la littérature que la réponse à l’hormone lutéinisante dans les cellules stéroïdogéniques s’effectue principalement par l’intermédiaire de l’adénylate cyclase et du second messager AMPc (126, 127). En effet, l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la stéroïdogenèse peut être stimulée par l’ajout d’analogues de l’AMPc et permet d’obtenir une réponse semblable en intensité à l’utilisation de LH (128). L’utilisation d’analogues de l’AMPc tels le 8-Bromo-cAMP et le dibutyryl-cAMP, peu ou pas hydrolysables par les enzymes cytoplasmiques, permet d’obtenir une réponse soutenue. Ces caractéristiques ont motivé leur utilisation dans bon nombre d’études ayant trait à la compréhension de la stéroïdogenèse. Malgré l’apport substantiel à la compréhension de la stéroïdogenèse que ces expériences ont apporté, il serait imprudent d’assumer qu’il s’agit de la seule voie de signalisation importante pour la stéroïdogenèse. Il n’en reste pas moins que les principales voies de signalisation impliquées dans la régulation de la stéroïdogenèse sont celles du calcium et de la PKA, deux effecteurs situés en aval de l’AMPc (129, 130). Diverses évidences ont été
mises de l’avant pour montrer que l’inhibition de ces effecteurs diminue grandement le potentiel stéroïdogénique des cellules de Leydig.
La stimulation du récepteur de la LH (LHR) active sa fonction de facteur d’échange de guanosine et active une protéine Gs. La sous unité Gα va alors s’associer à l’adénylate cyclase et produire de l’AMPc. La fonction de la sous-unité Gβγ est, dans le cas de la stéroïdogenèse des cellules de Leydig, moins claire (131, 132).
De toute évidence beaucoup d’autres voies secondaires sont activées par la LH, en particulier la voie de la protéine kinase C ainsi que de la phospholipase C (133-137). Certaines évidences semblent montrer une augmentation de la quantité d’IP3 et de calcium dans la cellule suite à une stimulation du LHR (87, 136, 138). Certaines autres évidences ne semblent pas montrer que cette voie est active dans les cellules de Leydig (132). À première vue, ceci semble aller à l’encontre de la logique puisque l’on sait que la voie des ERK/JNK est active dans les cellules de Leydig stimulées (119, 130). Il existe cependant un mécanisme alternatif par lequel il serait possible d’outrepasser l’activation de la PKC par le DAG, normalement nécessaire à l’activation de la voie ERK/JNK. Un facteur d’échange du GTP (EPAC) peut agir, en réponse à l’AMPc, comme activateur direct de la voie JNK/ERK (139). Cependant, des essais non publiés effectués dans le laboratoire du Dr Jacques J. Tremblay se sont montrés peu concluants pour faire la démonstration de l’importance de cette voie dans la stéroïdogenèse. Certains points restent donc à éclaircir sur l’importance de la voie PLC et de ses seconds messagers dans le contexte de la libération de calcium et de la stéroïdogenèse au sens large.
Parallèlement, il a été supposé que si la libération de calcium observée dans les cellules de Leydig n’est pas due à la fixation de l’IP3 au réticulum endoplasmique, alors la PKA pourrait par elle-même agir pour stimuler l’ouverture des canaux à ryanodine (140). Les données amassées par notre laboratoire semblent d’ailleurs pointer vers ce mécanisme d’action (129), mais il est clair que d’autres études restent à accomplir quant à l’importance de la phospholipase dans les cellules de Leydig. Ceci est d’autant plus vrai que les canaux à ryanodine sont normalement des canaux ion-dépendants et que l’ouverture des canaux calciques par l’IP3 pourrait être responsable d’une boucle de rétroaction positive via les récepteurs à la ryanodine. Ces derniers ont été démontrés comme étant nécessaires pour l’augmentation de la stéroïdogenèse en réponse à une stimulation (129).
Cette considération est complémentaire au fait que la surexpression transitoire de PKA constitutivement active ne semble pas suffire pour activer la libération de calcium dans les cellules de Leydig (141). Par ailleurs, des publications au niveau du cœur ont montré une hyperphosphorylation des canaux à ryanodine en réponse à la
