Les approches in vivo

Les études in vivo sont effectuées sur des volontaires humains ou sur des animaux de laboratoire, en général des rongeurs. Le rat est l’espèce la plus souvent utilisée pour ces études in

vivo, en raison du nombre d’études de toxicologie et de pharmacocinétique déjà effectuées sur ce modèle. Le rat mâle est l’animal préconisé pour les études de diffusion cutanée in vivo par l’OCDE et l’agence américaine de protection de l’environnement (USEPA). Cependant, il est généralement admis que les résultats d’absorption percutanée obtenus chez le rat sont surestimés par rapport à l’homme. Le principal désavantage de l’utilisation d’animaux de laboratoire est la différence morphologique et enzymatique entre la peau de rongeurs et la peau humaine. On peut parfois observer des facteurs de transfert 2 à 10 fois moindre pour l’homme, expliqués par une structure et une épaisseur de l’épiderme humain très différentes (Rougier et al., 1987). L’utilisation du porc ou du singe, chez qui la structure de l’épiderme est proche de celle de l’homme est souhaitable, mais toutefois difficile dans le cas des études cinétiques qui nécessitent de nombreux individus, du fait de la taille de ces animaux et, dans le deuxième cas, des difficultés inhérentes à l’expérimentation sur les primates.

Plusieurs types d’études sont effectués in vivo sur la peau, des études toxicocinétiques, de toxicité aigüe, d’irritation, de corrosion ou de sensibilisation cutanée. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux études de passage et de métabolisation cutanée.

Pour l’étude du passage et du métabolisme cutané, trois types d’études sont réalisés in vivo, après application du composé sur la peau :

• quantification du composé d’intérêt dans le sang et les excreta

• quantification du composé dans la peau après biopsie

• quantification du composé dans les différents tissus.

a. Principe d’un test in vivo standard chez l’animal

L’étude de l’absorption percutanée et du métabolisme in vivo consiste à appliquer une quantité définie d’une substance à étudier pendant une durée établie sur une surface et un site anatomique définis (le dos et l’oreille pour l’animal) (Reifenrath et al., 1991). Les animaux sont alors placés en cage à métabolisme pendant la durée de l’expérimentation, avant d’être sacrifiés.

Afin de connaître la quantité totale absorbée et les métabolites formés, les excreta, les fluides biologiques et les tissus sont prélevés à des temps donnés et analysés pour quantifier le composé d’intérêt et ses métabolites. De nombreuses méthodes permettent de quantifier l’absorption percutanée in vivo mais en raison des très petites quantités de xénobiotiques absorbées par la peau, beaucoup d’auteurs ont eu recours à l’emploi de molécules radio-

marquées. L’emploi de molécules radiomarquées est recommandé par l’OCDE pour les études de diffusion percutanée in vivo ou in vitro. La substance à tester est idéalement radiomarquée sur une position métaboliquement stable et appliquée sur 5 à 10% de la surface de la peau de l’animal (chez le rat : 10 cm²). L’OCDE recommande d’appliquer 10 µl/cm² pour une substance liquide et 1 à 5 mg/cm² pour un solide. La quantification de la radioactivité peut se faire dans les excreta, dans le plasma et dans la peau elle même.

La zone du dépôt peut être délimitée par un cylindre, en verre ou en plastique, fixé à la surface cutanée par des colles cyanolites.

La durée de l’expérience doit refléter les conditions physiologiques : une exposition comprise entre 6 et 24 heures entre le dépôt de la molécule d’intérêt et le nettoyage du site d’application. Selon l’OCDE, les animaux doivent être sacrifiés à des intervalles de temps différents (1, 2, 4, 10 et 24 heures) afin d’effectuer une cinétique pour tous les tissus.

Un bilan est effectué avec l’étude de la répartition de la radioactivité à la surface de la peau, dans la peau (épiderme, derme), l’urine, les fèces, l’air expiré, le sang et la carcasse de l’animal. La radioactivité retrouvée doit être comprise entre 90 et 110% de la radioactivité appliquée au début de l’expérience. Le taux d’absorption est habituellement donné en pourcentage de la dose appliquée et obtenu en additionnant les quantités récupérées dans l’urine, les fèces, l’air expiré, le sang, la carcasse et la peau. Si l’animal n’est pas sacrifié, il y a une estimation de l’absorption basée sur les mesures dans l’urine, des fèces et du sang (OECD 427).

b. Principe d’un test in vivo standard chez l’homme

Chez l’homme, l’étude de l’absorption est limitée aux produits non toxiques et est étroitement réglementée par la Déclaration d’Helsinki de 1964 et celle de la World Medical Association de 2004. L’utilisation de radioéléments chez l’homme est par ailleurs réglementée par la Commission Internationale de Protection Radiologique (CIPR). L’étude de l’absorption percutanée chez l’homme est effectuée par analyse du plasma, des excreta, de l’air expiré, du stratum corneum par tape stripping (élimination du stratum corneum par arrachages successifs à l’aide d’adhésifs normalisés) ou par biopsie cutanée.

c. Facteurs influençant l’absorption et le métabolisme cutané in vivo

La peau des rats, des cobayes, des souris et des lapins est plus perméable que la peau humaine, la peau des cochons et celle des singes (Bartek et al., 1972).

Les études sur volontaires humains ont montré une grande variabilité interindividuelle en fonction de l’âge du volontaire, du site d’application, de l’épaisseur du stratum corneum et du mode de vie de l’individu (alimentation, prise de médicaments, etc.). Ces variations rendent difficile la comparaison entre individus pour une même molécule ou pour des molécules différentes.

La différence de perméabilité de la peau selon les espèces, la variabilité interindividuelle et les raisons éthiques (limitation de l’utilisation d’animaux de laboratoire) ont conduit au développement de méthodes alternatives (in vitro et ex vivo) à l'expérimentation animale ces dernières années tant au niveau des industries cosmétiques que chimiques (via la directive REACH).