Adaptation du modèle en fonction de la molécule étudiée

Pour toutes les études ex vivo et in vitro, des molécules marquées au carbone 14 ont été utilisées. Leurs positions de marquage sont résumées dans la Figure 18. Le véhicule de dépôt, le milieu de culture et les temps d’incubations ont été adaptés en fonction de la solubilité de chaque molécule étudiée. L’un des paramètres permettant de caractériser la solubilité d’un produit chimique se définit par son log Kow, coefficient de partage octanol/eau. Plus une molécule est hydrosoluble, plus son log Kow est faible. Plus une molécule est hydrophobe plus son log Kow est élevé.

Figure 18: Position(s) de marquage au carbone 14 des molécules étudiées

O

CH₃

OH

CH₃

*

Testostérone marquée en position 4 O

O O

H₅C₂

*

7-éthoxycoumarine marquée en position 3

*

*

Benzo(a)pyrène marquée en position 4 et 7 Bisphénol A marquée uniformément

sur les deux cycles O

CH₃

OH

CH₃

*

Testostérone marquée en position 4 O CH₃ OH CH₃

*

*

Testostérone marquée en position 4 O

O O

H₅C₂

*

7-éthoxycoumarine marquée en position 3 O O O H₅C₂

*

*

7-éthoxycoumarine marquée en position 3

*

*

Benzo(a)pyrène marquée en position 4 et 7

*

*

Benzo(a)pyrène marquée en position 4 et 7

**

Benzo(a)pyrène marquée en position 4 et 7 Bisphénol A marquée uniformément

sur les deux cycles

Bisphénol A marquée uniformément sur les deux cycles

a. 7-Ethoxycoumarine (7-EC)

Dans l’objectif d’étudier la diffusion et le métabolisme de molécules ayant des propriétés physicochimiques différentes, deux véhicules de dépôt ont été testés pour la 7-EC. L’un, permettant la solubilisation de composés relativement hydrosolubles, est constitué d’éthanol et de tampon phosphate sodique (pH 7,4, 0,01 M) dans les proportions 1:2 (v/v). L’autre permet la solubilisation de molécules plus liposolubles, il est composé d’éthanol et d’un mélange de triglycérides caprique/caprylique dans les mêmes proportions (Myritol, Pierre Fabre Dermo- cosmétique).

Le milieu d’incubation de base décrit précédemment a été utilisé pour cette molécule. La 7-EC est une molécule hydrophile (log Kow 1,3) et sa diffusion à travers la peau est rapide. Son passage à travers la peau a été suivi sur de courtes et de longues périodes: 2, 4, 6, 24, 48 et 72 heures. Pour ces études, nous avons utilisé de la 7-EC radio-marquée au carbone 14 en position 3, de radiopureté > 99,1% et d’activité spécifique 2 GBq/mmol soit 54 mCi/mmol (Amersham Biosciences, UK). La 7-EC non marquée, de masse molaire 190 g/mol et de pureté > 99% (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France), a également été utilisée dans la préparation des solutions de dépôt (Table 2).

b. Testostérone

Cette molécule possède un log Kow de 3,3, il s’agit donc d’une molécule plutôt lipophile. En se basant sur les résultats obtenus avec la 7-éthoxycoumarine, un mélange aqueux a donc été choisi comme véhicule de dépôt, constitué d’éthanol et de tampon phosphate sodique (0,01M; pH 7,4) dans les proportions 1:2 (v/v). En ce qui concerne le milieu récepteur, le milieu de culture de base supplémenté avec de l’acide ascorbique 50mM, comme antioxydant, a été utilisé afin d’éviter la dégradation des métabolites formés. Pour de ne pas perturber l’identification en spectrométrie de masse des métabolites de la testostérone, du DMEM sans rouge de phénol a été utilisé. Le suivi de la diffusion de la testostérone à travers la peau a été effectué sur des courtes et longues périodes d’incubation : 4, 24, 48 et 72 h. Nous avons utilisé de la testostérone marquée au carbone 14 en position 4, de radiopureté > 98,5% et d’activité spécifique 2,074 GBq/mmol soit 56 mCi/mmol (Amersham Biosciences, UK). De la testostérone non marquée de poids moléculaire 288 g/mol et de pureté > 99% (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France), a également été utilisée dans la préparation des solutions de dépôt (Table 2).

c. Benzo(a)pyrène [B(a)P]

Cette molécule a un log Kow de 6,5 ; il s’agit d’une molécule très peu soluble en milieu aqueux. Plusieurs véhicules de dépôt ont donc été testés afin d’optimiser la pénétration du B(a)P dans la peau. En se basant sur les données de la littérature et les essais de solubilisation effectués (diméthylsulfoxyde (DMSO), éthanol, myritol, acétone), il a été conclu que l’un des seuls solvants permettant de dissoudre le B(a)P aux fortes concentrations, tout en conservant les propriétés de la barrière cutanée, est l’acétone. Ce solvant a donc été choisi comme véhicule de dépôt.

En raison du caractère hydrophobe du B(a)P, un agent solubilisant : l’albumine de sérum bovin (BSA ; 4%) a été ajoutée au milieu de culture de base. L’ajout d’agent solubilisant est préconisé par l’OCDE et le SCCP afin d’éviter que le milieu de culture s’oppose au passage de la substance du derme vers le compartiment receveur. Le milieu de culture a été supplémenté avec de l’acide ascorbique (50mM) afin d’éviter la dégradation des métabolites formés. Le suivi de la diffusion du B(a)P a été effectué toutes les 24 heures pendant 72 heures. Pour ces études, nous avons utilisé du B(a)P marqué au carbone 14 en position 4 et 7, de radiopureté > 97,5% et d’activité spécifique 2,257 GBq/mmol soit 61 mCi/mmol (Amersham Biosciences, UK). Du B(a)P non marqué de poids moléculaire 252 g/mol et de pureté > 99%) (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France), a également été utilisé dans la préparation des solutions de dépôt (Table 2).

d. Bisphénol A (BPA)

Le caractère lipophile du BPA ou 4,4’-isopropylidénediphénol (N° CAS 80-05-07) est proche de celui de la testostérone (log Kow 3,2), le même véhicule de dépôt a donc été utilisé, à savoir un mélange constitué d’éthanol et de tampon phosphate sodique (pH 7,4, 0,01 M) dans les proportions 1:2 (v/v). Le suivi de la diffusion du BPA a été effectué toutes les 24 heures pendant 72 heures. Comme pour la 7-EC, le milieu de culture de base a été utilisé pour l’étude du BPA.

Pour la préparation des solutions de dépôt, du BPA marqué au carbone 14 de manière homogène sur les cycles aromatiques, de radiopureté > 98,5% et d’activité spécifique 2,074 GBq/mmol soit 56 mCi/mmol (Amersham Biosciences, UK) a été utilisé ainsi que du BPA non marqué (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France), de poids moléculaire 228 g/mol et de pureté > 99% (Tableau 2).

7-EC Testostérone B(a)P BPA

Log Kow 1,3 3,3 6,5 3,2

Poids moléculaire

(g.mol-1) 190 288 252 228

Pureté molécule froide 99,1% 99% 97,5% 99%

Position du marquage

au carbone 14 Position 3 Position 4 Position 4 et 7 Sur les deux cycles

Activité spécifique

(mCi.mmol-1) 54 56 61 56

Radiopureté 99% 98,5% 99% 98,5%

Tableau 2: Propriétés physicochimiques des molécules étudiées 5. Bilan de radioactivité pour l’absorption percutanée

Chaque molécule radioactive a été déposée sur les explants de peau en triplicat à différentes concentrations. Après incubation à 37°C sous CO2 pour des durées allant de 2 à 72 heures, les milieux ont été prélevés pour analyses et renouvelés.

En fin d’expérimentation, la radioactivité a été dosée dans les différents compartiments des cellules de diffusion : surface de l’explant, peau, milieu de culture, afin d’obtenir un bilan de la répartition de la molécule marquée. Ces résultats ont permis d’évaluer l’effet barrière de la peau d’oreille de porc en survie mais aussi de voir l’influence des propriétés physicochimiques d’une molécule sur sa diffusion et sa biotransformation.

a. Surface de l’explant de peau, milieux de culture, inserts et puits

Le schéma ci-dessous récapitule les techniques d’extraction utilisées pour chaque compartiment du modèle de peau d’oreille de porc.

Figure 19: Protocole d’extraction de la radioactivité pour les différents compartiments du système ex vivo de peau d’oreille de porc

A l’exception des explants de peau d’oreille de porc eux mêmes, les différents compartiments (milieux de culture, surface de la peau, inserts et puits) ont été traités de la même manière en adaptant les solvants d’extraction à chaque molécule (Tableau 3).