Percutaneous absorption and metabolism of [ 14 C]-ethoxycoumarin in a pig ear skin model
2. Etude de la diffusion et du métabolisme de la testostérone par le modèle de peau d’oreille de porc ; comparaison avec des études sur des fractions
subcellulaires
a. Présentation de l’étude (Article 2)
Le métabolisme de la testostérone par des microsomes de foie et de peau de porc et d’homme a été étudié à partir de [14C]-testostérone testée à différentes concentrations. La diffusion et la métabolisation de la testostérone par les explants de peau d’oreille de porc ont ensuite été étudiées pour différentes doses (50, 100, 200, 400, 600 et 800 nmoles) de testostérone appliquée dans 60µl d’un mélange éthanol/tampon phosphate (1/2, v/v). Les cinétiques de diffusion et de métabolisation cutanée de la testostérone ont été déterminées à différents temps dans le but de décrire les capacités de diffusion, distribution et biotransformation du modèle de peau d’oreille de porc. Compte tenu, du grand nombre de métabolites pouvant être formés, les identifications ont été effectuées par GC-MS/MS. Ces travaux ont donné lieu à l’écriture d’une publication qui vient d’être achevée et qui sera soumise à Pharmaceutical Research (Article 2).
b. Résultats
A partir des microsomes de foie humain ou de porc, la métabolisation est qualitativement importante (13 métabolites détectés) et les mêmes métabolites sont obtenus chez le porc et chez l’homme. Avec les microsomes de peau des deux espèces, la métabolisation est onze fois plus faible que dans les microsomes de foie, mais les mêmes métabolites (3 métabolites détectés) sont produits chez l’homme et chez le porc.
Pour les études ex vivo sur les explants de peau d’oreille de porc, un bilan de la radioactivité présente dans les différents compartiments a été effectué (Table 1, Article 2). Quelle que soit la dose de testostérone déposée, moins de 1% est retrouvé non absorbé à la surface de l’explant. La radioactivité diffuse de manière importante à travers la peau. Par exemple, pour 100 nmoles de testostérone appliquée sur l’explant, 48.9 ± 0.5% sont retrouvés dans le milieu récepteur après 24h d’incubation et 86,5 ± 4.6% à 72 heures. Contrairement à la 7-EC, le pourcentage de radioactivité retrouvé dans les milieux récepteurs décroit en fonction de la dose de testostérone déposée sur la peau. Cette différence pourrait être due au caractère moins hydrophile de la testostérone.
Les milieux de culture et les explants de peau ont été analysés en radio-HPLC afin de séparer et de quantifier les différents métabolites formés qui ont été identifié en GC-MS/MS. Plus de 95% de la radioactivité retrouvée dans les milieux de culture et la peau elle-même correspondent à des métabolites. Quelle que soit la dose de testostérone appliquée, la diffusion de la radioactivité à travers la peau est donc majoritairement due au métabolisme. Différents types de métabolites ont été identifiés en GC-MS/MS dans les milieux récepteurs et les extraits de peau : OH-testostérone, OH-Δ4-diones, androsténedione, 5α-androstane-3,17dione, androstérone, epiandrostérone, Δ6- dione (Figure 30). Certains de ces métabolites sont caractéristiques de familles de cytochromes P450 et ont permis de montrer que celles-ci étaient fonctionnelles dans le modèle de peau d’oreille de porc. Ainsi, la 6β-OH-testostérone et la 16α-OH-testostérone sont majoritairement issues de la métabolisation chez l’homme par les familles de cytochromes 2C et 3A alors que la 7α-OH-testostérone est produite via le cytochrome 2A1 (Waxman et al., 1991; Anzenbacher et al., 1998; Bogaards et al., 2000; Soucek et al., 2001). L’androstérone est formée à partir de la 5α- androstane-3,17dione via le cytochrome 19A1, aussi appelé aromatase (Desille et al., 1999; Bogaards et al., 2000).
c. Conclusion
Tout comme dans les travaux de Kao and Hall portant sur le devenir de la testostérone sur des explants de souris, le modèle de peau d’oreille de porc a un effet barrière maintenu pendant 72 heures. La diffusion de la radioactivité observée correspond essentiellement à des métabolites.
L’étude du métabolisme de la testostérone par les explants de peau a permis de démontrer la fonctionnalité de certaines enzymes de phase I. Ces enzymes n’ont pas été caractérisées mais peuvent correspondrent aux familles de cytochrome P450 impliquées dans le métabolisme de la testostérone chez l’homme (CYP 2C, CYP 3A, CYP19A1 et le CYP2A1). Ces résultats concordent avec ceux obtenus dans des biopsies de peau humaine où ces CYP ont été détectes par immuno-histochimie, en particulier le CYP3A4 responsable de l’hydroxylation en position 6β de la testostérone (Oesch et al., 2007).
L’incubation de la testostérone avec des microsomes de foie et de peau de porc et d’homme a permis d’effectuer un comparatif entre les deux espèces. Les voies métaboliques sont identiques chez l’homme et chez le porc puisque les mêmes métabolites ont été identifiés. Le métabolisme de la testostérone est plus limité dans la peau que dans le foie (11 fois plus faible) aussi bien chez le porc que chez l’homme. Compte tenu de la surface de la peau et de son contact permanent avec l’environnement extérieur, cette voie d’exposition et de métabolisation est
cependant loin d’être négligeable et doit être prise en considération, puisque des patchs transdermiques de testostérone (Testopatch®, Intrinsa®) sont couramment utilisés pour le traitement de l’hypogonadisme masculin ou en association à une estrogénothérapie chez la femme. Les similitudes de métabolisme de la testostérone mises en évidence sur fractions subcellulaires du porc et de l’homme confortent le choix de la peau de porc comme modèle alternatif à la peau humaine. Le modèle de peau d’oreille de porc semble adapté aux études de diffusion et de métabolisme cutané pour les molécules lipophiles comme la testostérone.
Article 2
Percutaneous absorption and biotransformation of [14C]-testosterone in a pig ear skin model.
Carine JACQUES1, Elisabeth PERDU1, Hélène DUPLAN2, Emilien L. JAMIN1, Cécile CANLET1, Laurent DEBRAUWER1, Jean Pierre CRAVEDI1, Alain MAVON2 and Daniel
ZALKO1
Pharmaceutical Research
En cours d’écriture
1
INRA, UMR1089 Xénobiotiques, F31000 Toulouse, France 2
Pierre Fabre Dermo-cosmétique, Laboratoire de Pharmacocinétique Cutanée, Allée Camille Soula, BP 74, 31322 Vigoulet, France.