Identification et caractérisation structurale en spectrométrie de masse et RMN

L’utilisation de méthodes complémentaires aux méthodes biochimiques a été nécessaire afin d’identifier les produits formés aussi bien par le modèle de peau d’oreille de porc que par les modèles in vitro. Pour le B(a)P que pour la testostérone, un grand nombre de métabolites ont été formés par le modèle ex vivo de peau d’oreille de porc et les modèles in vitro. L’objectif était de développer des méthodes de caractérisation structurale relativement faciles à mettre en œuvre, notre choix s’est donc porté sur l’utilisation de la spectrométrie de masse et de la RMN pour le B(a)P et la testostérone. Un couplage entre l’HPLC et la spectrométrie de masse (LC-MS) a été utilisé pour l’identification structurale des métabolites du B(a)P, cette méthode permettant une injection directe de l’échantillon, deux modes d’ionisation ont été utilisés (ESI et APCI) afin d’identifier tous les métabolites formés. Les métabolites de la testostérone n’ont pas pu être identifiés en LC/MS en raison des difficultés d’ionisation de certains métabolites, les analyses ont donc été réalisées par couplage entre la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (GC-MS). Cette méthode a nécessité la collecte individuelle en radio-HPLC de tous les métabolites formés par le modèle ex vivo de peau d’oreille de porc et des modèles in vitro.

a. Spectrométrie de masse

Les identifications structurales ont été réalisées en spectrométrie de masse en utilisant différents spectromètres de masse en fonction des propriétés physicochimiques des métabolites étudiés. Concernant les analyses réalisées par couplage entre l’HPLC et la spectrométrie de masse (LC-MS), un spectromètre de type piège à ions LCQ (Thermo Fisher, Les Ulis, France), équipé soit d’une source Electrospray (ESI), soit d’une source d’Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique (APCI), a été utilisé. Cet appareil a également permis de réaliser des analyses de spectrométrie de masse en tandem (MSn). Concernant les analyses réalisées par couplage entre la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (GC-MS), un analyseur de type piège à ions Polaris (Thermo Fisher, Les Ulis, France) équipé d’une source d’Impact Electronique (EI) a été utilisé. Le système de chromatographie en phase gazeuse qui était couplé à cet instrument était un Trace GC 2000 (Thermo Fisher, Les Ulis, France).

b. Résonance magnétique nucléaire

La structure des métabolites produits en assez grande quantité a été précisée par des études en résonance magnétique nucléaire du proton (1H-RMN) en utilisant un spectromètre Bruker Avance DRX-600 (Bruker, Wissembourg, France), à 600,13 MHz équipé d’une sonde cryogénique TXI (5 mm H, C, N inverse triple résonance).

V. TTrraaiitteemmeennttssttaattiissttiiqquuee

Les comparaisons entre les valeurs moyennes ont été effectuées via un test de Student avec le logiciel Instat (Graph Pad software). Les valeurs des Km and Vm ont été déterminées par une analyse de régression non linéaire comme indiqué par Loft et Poulsen (1989).

Chapitre 4 :

Résultats

Lors de ce travail, la caractérisation de la capacité métabolique de la peau d’oreille de porc a été effectuée au travers de l’étude des voies de biotransformation ex vivo de quatre molécules : la 7-éthoxycoumarine, le bisphénol A, le benzo(a)pyrène et la testostérone. Les données ont été comparées aux résultats obtenus avec des fractions subcellulaires, qui sont un modèle in vitro classiquement utilisées dans les études de métabolisme.

Dans une première partie sont développés les travaux ayant permis de mettre au point le modèle de peau d’oreille de porc et d’évaluer ses capacités métaboliques vis-à-vis de la 7- éthoxycoumarine. Cette étude a été valorisée par une publication dans Toxicology In Vitro au cours de ma thèse (Article 1).

Dans une deuxième partie est décrite l’étude effectuée avec la testostérone, molécule recommandée par l’OCDE pour la mise en place de modèles alternatifs à la peau humaine. De part ses propriétés physicochimiques, cette molécule diffuse facilement à travers la peau et elle est utilisée pour caractériser l’activité de différentes isoformes de cytochromes P450. Ce composé a permis la mise en évidence des enzymes de phase I présentes dans la peau, ainsi que leur fonctionnalité dans le modèle ex vivo. Le métabolisme de la testostérone a aussi été étudié avec des systèmes in vitro : fractions microsomales de foie et de peau ainsi que « slices » de foie. Cette étude a également fait l’objet d’une publication écrite durant ma thèse, qui sera soumise sous peu au journal Pharmaceutical Research (Article 2).

Dans une troisième partie, le travail sur le B(a)P a permis d’affiner la caractérisation des capacités métaboliques du modèle ex vivo de peau d’oreille de porc et d’adapter ce modèle à l’étude de molécules hydrophobes. Des études in vitro ont été réalisées avec des « slices » de foie de rat et des fractions microsomales de foie et de peau de rat, de porc et d’homme. Ces études complémentaires ont permis d’évaluer les capacités oxydatives des explants de peau d’oreille de porc comparativement à celles du foie mais surtout d’aborder la comparaison des capacités métaboliques de la peau de porc et de la peau humaine. Ces travaux ont été concrétisés par deux publications durant ma thèse (Articles 3 et 4 : respectivement acceptés et soumis dans Analitycal and Bioanalytical Science et Toxicology Letters).

Dans une dernière partie, le modèle de peau d’oreille de porc a été utilisé pour évaluer la diffusion et le métabolisme du bisphénol A, xénobiotique dont l’impact sur la santé humaine est soupconné, en raison de ses propriétés estrogéno-mimétiques. Le taux de pénétration de ce composé dans la peau et son devenir a été étudié avec des explants de peau d’oreille de porc en survie, ainsi qu’avec des explants de peau humaine. Cette étude a été concrétisée par une publication soumise dans Chemosphere (Article 5).

Afin de mettre au point certains paramètres du modèle de peau d’oreille de porc ainsi que les méthodes analytiques nécessaires à l’identification et à la quantification des métabolites formés, des études préliminaires ont été effectuées pour chaque molécule. Pour la 7-EC, différents véhicules de dépôt ont été testés pour voir l’influence de celui-ci sur la diffusion et la métabolisation de la molécule étudiée. Un système in vitro de « slices » de foie de rat a été utilisé pour mettre au point les techniques d’analyse en radio-HPLC et spectrométrie de masse, des métabolites du B(a)P et de la testostérone.

I.

EEttuuddeeddeellaa77--éétthhooxxyyccoouummaarriinnee((77--EECC))

De par son poids moléculaire et ses propriétés physico-chimiques (190.8 g.mol-1, log Kow de 1.3), la 7-EC peut diffuser facilement à travers la peau. Les travaux de Storm et al (1990) ont montré une diffusion importante de cette molécule dés 6 heures à travers la peau de différentes espèces (rat, souris, cobaye et homme) et plus de 70% de la radioactivité appliquée est dans ce cas retrouvée dans les milieux récepteurs après 24 heures d’incubation.

Figure 27: Schéma des voies de biotransformation de la 7-éthoxycoumarine

O O OH O H O OH COOH O H O O H OH O O OH H5C2 O O OH S O O O H Phase II Phase I Hydroxycoumarine OH-C 7-O-glucuronide G-O-C 7-O-sulfate S-O-C O O OH O H O OH COOH O H O O H OH O O OH H5C2 O O OH S O O O H Phase II Phase I Hydroxycoumarine OH-C 7-O-glucuronide G-O-C 7-O-sulfate S-O-C

La 7-EC est couramment utilisée comme molécule modèle pour mesurer les activités métaboliques des « slices » de foie ou encore celle de fractions subcellulaires (de Kanter et al., 2005). Son métabolisme donne lieu à la formation de trois métabolites : l’hydroxycoumarine, résultant de l’activité de la 7-éthoxycoumarine-O-dééthylase et deux conjugués, l’un à l’acide glucuronique et l’autre au sulfate (Steensma et al., 1994; Ball et al., 1996) (Figure 27). Après application topique, la détection de ces trois métabolites dans les milieux récepteurs du modèle de peau d’oreille de porc permet de vérifier la fonctionnalité des enzymes de biotransformation du modèle (enzymes de phase I et de phase II).

La 7-EC a également servi de contrôle positif lors des études in vitro avec les microsomes et les « slices » de foie incubés avec la testostérone et le B(a)P.