Les antiports cation/H +

Les antiports cation/H+ sont situés dans la membrane de la vacuole. Ils participent à la régulation des concentrations en Na+ et Ca2+ dans le cytoplasme (Maeshima, 2001 ; Gaxiola et

al., 2002). Deux gènes CAX (cation exchangers), codant pour des transporteurs de ce type,

ont été isolés chez Arabidopsis thaliana (Hirschi et al., 1996). Salt et Wagner (1993) ont montré que CAX2 était impliqué dans l’accumulation de Cd dans les vacuoles de racines d’avoine. Des plantes transgéniques de tabac exprimant les gènes AtCAX2 et AtCAX4 ont permis de démontrer le rôle de ces deux protéines dans la tolérance du tabac aux fortes concentrations de Cd, Zn et Mn (Korenkov et al., 2007). Le rôle de ces transporteurs CAX dans l’accumulation du Pb n’a pas été mis en évidence.

La figure 6 résume les différents mécanismes mis en place par la cellule végétale en réponse aux métaux.

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Figure 6 : Schéma récapitulatif des transporteurs des métaux lourds dans une cellule végétale

(Brunet, 2010).

IV. Etude des populations : outil pour la compréhension de

l’adaptation des plantes aux métaux lourds

La pollution des sols, due aux activités agricoles, industrielles et minières, est une des composantes majeures du changement global actuel. Les zones contaminées par les métaux lourds sont en général d'origine récente (apparues depuis l’ère industrielle) et occupent des aires bien délimitées. De ce fait, l’étude de ces sites demeure un enjeu essentiel afin de restaurer ces écosystèmes. Ces habitats représentant un modèle de référence pour étudier les processus évolutifs rapides d’adaptation à des facteurs écologiques très contraignants (Antonovics et al., 1971). Souvent des espèces végétales non résistantes aux métaux ont colonisé ces milieux en ayant acquis des capacités de résistance aux métaux lourds. Du fait des fortes pressions de sélection de ce type de milieu, les individus des populations nouvellement adaptées sont susceptibles de subir des changements rapides notamment en ce qui concerne le système de reproduction ou des traits d’histoire de vie comme la pérennité, le mode de dispersion ou la croissance. Une divergence génétique par dérive ou des mécanismes d’isolement reproducteur peuvent mener jusqu’à la spéciation (McNeilly, 1987).

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Dans le contexte de restauration de ces sites contaminés par les métaux, la technique de phytoremediation suscite de plus en plus l’intérêt des chercheurs. Elle se base sur l’exploitation de deux propriétés biologiques caractérisant certains taxons végétaux : la tolérance et l’hyperaccumulation. Afin de tirer profit de ces deux caractères biologiques en terme de dépollutions des sols, il demeure nécessaire de cibler au sein des espèces, les populations les mieux adaptées. Les études de populations passent d’abord par une compréhension au niveau phénotypique puis au niveau génétique de la distribution des polymorphismes pour ces caractères. Au delà de l’intérêt appliqué, l’étude de la tolérance et l’accumulation des métaux chez les plantes revêt aussi un intérêt fondamental. L’étude de variation entre populations issues d’habitats différents pour ces caractères permet de rechercher des corrélations entre le caractère d’accumulation ou de tolérance et les caractéristiques et les propriétés liées à l’habitat.

1. Classification des plantes des habitats métallifères

Les plantes qui sont capables de se développer uniquement sur des sols à fortes concentration en métaux lourds sont appelées des Metallophytes (Antonovics et al., 1971). Lambion et Auquier (1964) les ont réparties en deux groupes : (1) les metallophytes absolues, endémiques des sols métallifères (Viola calaminaria, Noccaea calaminare, Minuartia verna

ssp. Hercynica) et (2) les pseudo-metallophytes, que l’on rencontre à la fois sur des sites

métallifères et sur des sites non pollués. Ainsi les populations se développant sur les sites pollués sont qualifiés de populations métallicoles (M) et celles se développant sur les sites non contaminés de populations non-métallicoles (NM). Différentes classifications des métallophytes ont été proposées (Lambion and Auquier, 1964 ; Antonovics et al., 1971 ; Garcia-Ginzalez and Clark, 1989 ; Baker and Proctor, 1990). En 2002, Pollard et al ont schématisé la répartition des plantes vis-à-vis de leur tolérance et leur distribution géographique dans les sites métallifères ou non métallifères (Figure 7). Ainsi, les plantes peuvent être divisées en non-metallophytes strictes (obligatoires) ayant uniquement des populations NM et en metallophytes. Parmi les metallophytes, deux groupes peuvent se distinguer : (1) metallophytes facultatives (pseudometallophytes), espèces possédant les deux populations M et NM, et (2) metallophytes absolues (strictes) ou eumetallophytes, espèces ayant que des populations M endémiques aux sites métallifères. Il est à noter que la majorité des plantes appartient aux non-metallophytes (Figure 7, groupe A). Ces plantes sont sensibles aux ETM et leur aire de répartition est limitée aux sols avec des très faibles teneurs en

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métaux. L’autre groupe dit « pseudométallophytes » est formé des espèces capables de tolérer les ETM. Selon Pollard et al., (2002), ce groupe renferme deux catégories : (i) Espèces avec prédominance des populations survenant sur des sites non-métallifères (Figure 7, groupe B) et présentant une sensibilité aux ETM. Cependant des génotypes tolérants peuvent se développer (Figure 7 « ombre claire »). Le génotype tolérant peut être favorisé au sein de ces populations suite à la sélection naturelle durant la colonisation des sites métallifères. Pour ce dernier groupe on peut citer : Agrotis capillaris, Plantago lanceolata, Mimulus guttatus,

Silene vulgaris (Pollard et al., 2002) (ii) Espèces avec une prédominance des populations se

produisant sur des sols métallifères (Figure 7, groupe C) avec un caractère tolérant. Noccaea

montanum et Arabidopsis halleri appartiennent à cette catégorie.

Le dernier groupe est appelé eumetallophytes (Figure 7, groupe D) endémique aux sites métallifères, avec une tolérance élevée aux ETM. Plusieurs accumulateurs de nickel appartiennent à ce groupe notamment les espèces du genre « Alyssum » (Brooks et al., 1979).

Concernant le Pb, un site est qualifié de non-métallifère lorsque les teneurs du métal dans le sol est inférieur à 100 mg Kg-1. À l’opposé, au delà de ces normes, le sol est qualifié de métallifère.

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A- Nonmetallophytes, M = 0 C- Pseudometallophytes, M > NM B- Pseudometallophytes, NM > M D- Eumetallophytes, NM = 0

Figure 7 : Schéma de la répartition théorique des espèces végétale : A, B, C, D. Fréquence des

populations métallicole (M) et non métallicole (NM) ainsi que la distribution (fréquence) des génotypes tolérants et non tolérants (Pollard et al., 2002).

Tolérance des plantes au métal

Non tolérantes Tolérantes au métal

Fr

éque

nc

e des

g

énoty

pes

Non métallifères Métallifères

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2. Variabilité de la tolérance aux éléments-traces métalliques (ETMs)

La notion de tolérance aux ETMs a été définie comme étant la capacité d’une espèce à croitre et à se reproduire sur des sols pollués par les ETMs, et sur lesquels la plupart des espèces ne pourraient pas survivre à cause de la toxicité du milieu (Antonovics et al., 1971 ; Macnair et

al., 2000). La tolérance a évolué comme une réponse à une forte pression sélective causée par

une concentration élevée de métaux lourds dans le sol (Macnair et al., 2000) Elle est limitée seulement à certaines espèces notamment les Fabaceae et les Poaceae (Antonovics et al., 1971 ; Baker, 1987). La tolérance aux métaux lourds a été décrite pour la première fois par Pratt en 1934, qui a observé ce phénomène chez Silvestre Melandrium (Silene vulgaris) (Willems, 2006). Pratt (1934), a comparé la survie d’individus issus de graines provenant de déblais d’une mine de cuivre, à d’autres individus issus de graines provenant de sols non pollués. Sur des sols à forte concentration en cuivre, les individus provenant de sites normaux meurent rapidement tandis que les autres survivent. Par la suite, le même phénomène a été observé chez Agrostis tenuis pour la tolérance au Pb (Bradshaw, 1952) et chez Mimulus

guttatus (Macnair, 1983) pour la tolérance au cuivre. Ces travaux ont démontré que la

tolérance aux métaux lourds est un phénomène spécifique des métaux présents dans le sol d'origine des populations et déterminé génétiquement.

La tolérance est un caractère adaptatif rare et limitant pour l’installation des espèces, si bien que les écosystèmes métallifères récents présentent une faible diversité spécifique due à une dynamique de colonisation lente (Antonovics et al., 1971). Au contraire, les affleurements naturels peuvent accueillir une flore endémique diversifiée, par exemple, la flore des gisements de cuivre/cobalt d'Afrique (Brooks et al., 1990), et les flores serpentiniques de Nouvelle Calédonie ou de Californie (Baker et al., 1992). Ainsi, les variations de l’expression de la tolérance dépendent de la quantité de métal biodisponible dans le sol d’origine et aussi de la durée d’exposition de la flore (Baker and Walker, 1990).

L’une des premières études de populations a été menée sur une espèce des milieux humides,

Typha latifolia (McNaughton et al., 1974). En comparant deux clones, l’un issu d’un terrain

contaminé par du zinc et l’autre issu d’un terrain non pollué, McNaughton et son équipe ont montré que cette espèce présentait une forte tolérance au Zn, mais aussi au Pb et au Cd, et ceci sans distinction entre les deux clones. Par la suite, cette observation a été confirmée pour différentes espèces telles que Phragmites australis (Ye et al., 1997) en réponse au Pb,

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Calamagrostis epigejos pour le Cu (Lehmann and Rebele, 2004) et Arabidopsis halleri pour

le Cd et le Zn (Bert et al., 2000).

Des recherches portant sur l'évolution de la tolérance au Zn dans les populations NM d’Agrotis tenuis restent l'un des meilleurs exemples de processus d’adaptation (Al-Hiyaly et

al., 1988). À proximité des populations naturelles d’Agrotis tenuis, une fonderie de Zn a été

implantée, provoquant une pollution du sol. Après quelques années, les populations de la région ont développé des capacités de tolérance de zinc comparable à celle des populations métallicoles, issues des sites beaucoup plus âgés, situés en zone post-minier. Chez Agrotis

stolonifera, les populations métallicoles montrent une tolérance beaucoup plus élevée que les

populations NM après quatre ans d’exposition dans des sites métallifères (Wu et al., 1975). La même tendance a été observée chez Noccaea caerulescens, une espèce hyperaccumulatrice des métaux (Cd, Pb et Zn), où la tolérance est également un caractère constitutif (Meerts and van Isacker, 1997) mais la sélection naturelle l’a amplifié chez les populations M. Il semble que la tolérance aux métaux est un caractère qui peut évoluer rapidement. Des études ont montré que la tolérance aux métaux pourrait avoir évolué indépendamment des populations géographiquement éloignées (Mengoni et al., 2001 ; Pauwels et al., 2005).

La tolérance au Zn a été étudiée à grande échelle par Pauwels et son équipe (2006) chez 31 populations européennes d’Arabidopsis halleri en hydroponie. Ils ont montré que la tolérance au Zn est un caractère constitutif de cette espèce (Bert et al., 2002 ; Pauwels et al., 2006 ; Meyer et al., 2010). Ces travaux ont permis également de montrer l’existence d’une variation quantitative de la tolérance au zinc et la présence des génotypes les plus tolérants sur les sites métallicoles (Pauwels et al., 2006). En particulier, une tendance vers une plus grande tolérance et moins de polymorphisme a été montrée chez les populations M par rapport à ceux de NM (Meyer et al., 2010). Cette observation suggère que la tolérance au Zn pourrait avoir évolué secondairement dans les populations M. Néanmoins, le rôle possible de la sélection directionnelle dans l'élaboration de la variabilité de la tolérance au Zn chez les populations d’A. halleri n'a pas été établi. La plupart de ces études ont été basées sur les différences phénotypiques et physiologiques observées entre les populations provenant de sites métallifères ou non pollués. Cette distinction en deux écotypes M et NM n’est justifiée qu’après étude des bases génétiques par des approches de génétique moléculaires.

Certaines études génétiques ont porté sur la compréhension des histoires évolutives de la colonisation des sols pollués par les métaux chez les espèces pseudométallophytes. Ainsi

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Pauwels et al (2005) ont analysé la structure génétique sur plusieurs populations d’A. halleri en criblant le polymorphisme de séquence de trois régions du génome chloroplastique à l’aide des techniques de PCR-RFLP. Les résultats ont montré que les populations M seraient à l’origine d’une colonisation à partir de populations NM proches. En revanche les populations M situées dans des régions géographiques différentes montrent une forte différentiation. Ces résultats peuvent avoir une répercussion sur la stratégie de l’utilisation de cette espèce en phytoremédiation. L’apparition indépendante de tolérance dans les populations a posé la question de l’identité des mécanismes génétique à l’origine du caractère. Pauwels et al (2006) ont suggéré que si ces mécanismes sont différents, leur combinaison dans des descendances hybrides, issues du croisement entre populations d’origines différentes, pourrait accroitre les potentialités de l’espèce en termes de tolérance et de phytoremédiation.

D’autres études génétiques ont porté surdes populations appartenant à la même espèce. Elles se sont révélées très intéressantes pour détecter des gènes impliqués dans les mécanismes adaptatifs. Ainsi, une approche génétique des populations chez A. halleri a montré que le caractère de tolérance au zinc est sous le contrôle de 3 QTL (Quantitatif Trait Loci). Les régions QTL identifiées comprennent toutes des gènes dont les homologues chez A. thaliana participent au système régulateur de l’homéostasie des métaux (Willems et al., 2007). Une approche génétique chez A.halleri, en utilisant des marqueurs moléculaires, a été réalisée à grande échelle géographique dans laquelle les populations étudiées ont été isolées sur des sites séparés par plusieurs centaines de kilomètres (Pauwels et al., 2005 ; Pauwels et al., 2006). Ainsi, des différences génétiques ont été établies entre les populations M et NM mais l’effet de la différenciation phénotypique observée chez les deux populations est encore mal connu: la différenciation phénotypique pourrait être liée soit à des relations évolutives entre les deux populations ou à une adaptation locale spécifique des populations à la contamination métallique (Pauwels et al., 2006).

Des croisements entre des individus tolérants et non tolérants chez A. halleri ont montré que l’hyperaccumulation et la tolérance au Zn et au Cd chez cette espèce est gouverné par plusieurs gènes (Pauwels et al., 2008). En utilisant des marqueurs moléculaires RAPD (random amplified polymorphic DNA) et ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), Wojcik et al (2013) ont confirmé que la diversité morphologique, entre les populations M issues de sites riches en Zn-Pb et NM, chez Dianthus carthusianorum est accompagnée par leur divergence génétique.

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En conclusion, l’utilisation de la génétique moléculaire et écologique pour l'étude et la comparaison de la tolérance aux métaux chez les plantes améliore considérablement la connaissance globale des mécanismes de tolérance aux métaux. Elle fournit également un contexte actuellement inédit pour l'exploitation des gènes de tolérance aux métaux. Cette approche devrait rapidement permettre d'identifier les gènes de tolérance au métal qui, en retour, pourraient être étudiés chez d'autres pseudometallophyte ou espèces cultivées et enfin être utilisés en phytoremédiation.

3. (Hyper) accumulation : stratégie de tolérance aux ETMs

Parmi les individus tolérants aux métaux lourds, la plupart excluent les métaux de leurs parties aériennes (feuilles, tiges …) (Willems, 2006). Cette stratégie implique l’absorption et l’accumulation du métal dans les racines avec une limitation du transport du métal vers les parties aériennes (Baker, 1981). Cependant, certaines plantes sont capables de stocker de très grandes quantités de métal dans leurs parties aériennes, et sont dites plantes hyperaccumulatrices (Van der Ent et al., 2012). La mise en évidence de l’hyperaccumulation du nickel chez Alyssum bertolonii correspond à la découverte du phénomène (Minguzzi and Vergnano, 1948). Par la suite, le seuil d'hyperaccumulation du Ni a été défini en analysant les espèces des flores serpentiniques, qui montraient des concentrations foliaires supérieures à 1000 mg.kg-1 (Brooks et al., 1977), alors que la plupart des espèces contiennent 1-10 mg.kg-1, et que le seuil de toxicité se situe autour de 10-50 mg.kg-1 (Marschner, 1995). Cette définition s’est ensuite étendue aux autres métaux : le seuil d’hyperaccumulation est de 10 000 mg.kg-1

pour le Zn, 1 000 mg.kg-1 pour le Pb et 100 mg.kg-1 pour le Cd (Baker et al., 1994 ; Baker and Brooks, 1989 ; Van der Ent et al., 2012).

Aujourd’hui, 417 espèces de plantes présentant des individus tolérants et hyperaccumulateurs sont connues, aussi bien dans les zones tropicales que tempérées. La majorité d’entre elles (317 espèces) concerne l'hyperaccumulation du nickel (Baker et al., 2000). Les espèces hyperaccumulatrices de zinc arrivent en deuxième position, bien qu'elles soient en nombre beaucoup plus réduit. Elles appartiennent surtout à la famille des Brassicaceae, aux genres

Noccaea (11 espèces) et Arabidopsis (une espèce) (Baker and Brooks, 1989). Par contre, le

nombre de plantes décrites comme hyperaccumulatrices du Pb est restreint. Selon Bhargava et

al., (2012), seules 14 espèces auraient été identifiées comme hyperaccumulatrices du Pb et,

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Parmi les critères utilisés pour l’évaluation de l’hyperaccumulation se trouvent le ratio entre concentration du métal dans les parties aériennes et celle au niveau des racines (S/R ratio) (Salt and Kramer, 2000 ; Van der Ent et al., 2012), et le ratio entre la concentration au niveau des parties aériennes et la concentration au niveau du sol (FB : facteur de bioaccumulation) (Baker et al., 1994). Les plantes peuvent être qualifiées d’hyperaccumulatrices quand ces ratios sont supérieurs à 1.

Il y a un troisième groupe dit « espèces indicatrices », pour lesquels la concentration du métal au niveau des parties aériennes est proportionnelle à celle du sol (Baker, 1981) (Figure 8).

Figure 8 : Représentation schématique des stratégies rencontrées chez les plantes en réponse à une

augmentation des concentrations en métal dans le sol (Baker, 1981).

En abscisses et en ordonnées : concentrations en ETMs respectivement dans le sol et dans la plante.

L’hyperaccumulation a particulièrement été étudiée chez deux espèces de la famille des

Brassicaceae : Noccaea caerulescens, capable d’hyperaccumulation pour le zinc, le cadmium

et le nickel (Assunçao et al., 2003), et Arabidopsis halleri, hyperaccumulatrice de zinc et de cadmium (Bert et al., 2002). L’étude de la variation de la capacité à accumuler le zinc chez des populations métallicoles de N. caerulescens a montré qu’une multitude de variants existaient et que l’hyperaccumulation du zinc est un caractère à variation continue, ou quantitatif (Ingrouille and Smirnoff, 1986). De même, Pollard et Baker (1996) ont suggéré que l’hyperaccumulation du zinc chez N. caerulescens est soumise à un déterminisme polygénique, typique d’un trait quantitatif. L’étude de l’architecture génétique de l’hyperaccumulation du Zn et du Cd a permis de mettre en évidence quatre locus responsables de l’accumulation de ces deux métaux dont un des locus, qui est responsable de l’accumulation dans les racines, est commun aux deux métaux (Assunçao et al., 2006 ;

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Deniau et al., 2006). Une autre étude a également permis d’identifier deux locus responsables de l’accumulation du zinc chez A. halleri (Filatov et al., 2007).

Des études de populations ont été menées chez N. caerulescens et A. halleri portant sur des comparaisons en terme d’hyperaccumulation de Zn (Escarré et al., 2000 ; Bert et al., 2002). Ainsi, les individus non métallicoles cultivés sur sol contaminé, ont montré des capacités d’hyperaccumulation de Zn supérieures à celles des individus métallicoles. Cette capacité accrue d'hyperaccumulation du Zn par les populations non métallicoles pourrait être exploitée pour l’amélioration des espèces hyperaccumulatrices, en vue de leur utilisation en phytoextraction (Cunningham et al., 1995). Dans ce contexte, la connaissance des bases génétiques des différences de niveaux d'hyperaccumulation entre les deux écotypes est d’un grand intérêt.

Les mécanismes d’hyperaccumulation des autres métaux lourds tels que le Pb restent peu connus. L’élargissement des études génétiques s’avère donc nécessaire pour accéder à la compréhension de ce phénomène complexe.

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Chapitre II: