Chapitre III : Matériel & méthodes
B. Méthodes
I. Etude physiologique de la tolérance et l’accumulation du Pb des populations d’Hirschfeldia
1. Culture des plantes
Les graines d’H. incana, issus de 10 individus de chaque population, sont traitées séparément pendant 15 min avec du Domestos 20% (v/v) puis rincées 4 fois avec de l’H2O distillée
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and Skoog, 1962), supplémenté avec 1% (m/v) de saccharose et 8g/l de MS d’agar (agar-agar, Sigma) en boîtes de Pétri carrées (12 x 12 cm).
Les boîtes sont placées 48h à 4°C pour synchroniser la germination des graines. Les boîtes sont ensuite placées à la verticale en chambre de culture à 22°C, avec une photopériode de 16h de jour pendant 15 jours.
1.1. En condition hydroponique
Après 2 semaines, les plantules sont transférées en hydroponie en présence d’une solution nutritive BD (Annexe 2) (Broughton and Dilworth, 1971). Le traitement au Pb est réalisé 2 semaines plus tard en supplémentant une nouvelle solution de BD sans apport de phosphate (pour éviter la précipitation du Pb dans la solution de culture) en présence du Pb(NO3)2 à la
concentration souhaitée. Les concentrations en Pb(NO3)2 généralement utilisées se situent
entre 0 et 1mM. Notre but étant de tester les capacités de tolérance d’H.incana au Pb et les mécanismes qu’il met en jeu pour supporter cette contrainte, nous avons opté pour des concentrations en Pb de 50 µM et 100 µM.
Le traitement au Pb se déroule pendant environ 3 semaines en veillant à changer le milieu chaque semaine. Les plantules âgées de 7 semaines sont prélevées.
Pour les plantes destinées à l’extraction d’ARN, le traitement au Pb est réalisé pendant 3 jours en solution de BD sans apport de phosphate en présence de 0 ou 100 µM du Pb(NO3)2.
1.2. En sol contaminé
Après 4 semaines de culture en boites carrées, les plantules des deux populations sont transférées en sol contaminé issu du site de la région d’Oued El Heimer. Ensuite, les plantules sont acclimatées pendant 5 jours. Les pots sont arrosés 2 fois par semaines avec de l’H2O
distillée. Les plantes sont prélevées après un mois et demi de culture.
2. Récolte et conditionnement du matériel
Les différents organes végétaux (feuilles et racines) ont été prélevés, séparés et conditionnés en fonction des analyses à réaliser. Pour l'analyse du plomb, les feuilles et les racines (3 répétitions par échantillon), issues de la culture hydroponique, sont lavées successivement 2 fois 15 secondes (s) avec une solution de CaSO4 0,2 mM et une fois 15 s avec de l’H2O. Les
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parties aériennes et racinaires des différents échantillons est mesuré (âgées de 7 semaines). Ensuite, les échantillons sont séchés dans une étuve à 72°C pendant au moins 3 jours.
Pour la culture en sol, seules les parties aériennes sont récoltées et rincées suivant le même protocole.
3. Extraction des anthocyanes
Les feuilles de chaque individu, stockées à -80°c, sont broyées dans l’azote liquide. Environ 10 à 15 mg de broyat est homogénéisé dans 1.5 mL de la solution d’extraction (Annexe 3). Les échantillons sont ensuite incubés 3 min à 90°C puis centrifugés à 10 000 rpm pendant 2 min, le surnageant est ainsi récupéré dans un nouveau tube. Le contenu total en anthocyanes est estimé par spectrométrie. L’absorbance du surnageant est mesurée à 535 et à 650 nm, en prenant comme blanc la solution d’extraction. Le contenu en anthocyanes est exprimé en absorbance (A535 - A650) par mg de matériel frais.
Pour chaque condition, un tripliqua est réalisé. Les expériences sont reproduites au moins trois fois de manière indépendante (réplica biologique).
4. Extraction et dosage des chlorophylles
Les feuilles de chaque individu sont prélevées et broyées dans de l’azote liquide. Environ 0,1 g de broyat est homogénéisé en présence de 1 ml d'acétone à 80%. Le liquide obtenu est centrifugé pendant 1 min à 10 000 rpm pour éliminer tout tissu solide restant. Les échantillons sont ensuite analysés par spectrophotométrie à deux longueurs d'onde différentes (645 et 663 nm) en utilisant une solution d’eau 80% d'acétone comme témoin.
Le contenu en chlorophylle a et b a été déterminé à l'aide des équations suivantes (Bassa et
al., 2012).
Chl a = 0.999A663 - 0.0989A645 et Chl b = - 0.328A663 + 1.77A645 A représente l'absorbance.
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5. Dosage du Pb
5.1. Hydrolyse acide
5.1.1. Parties aériennes et racines
Le principe de l’hydrolyse acide repose sur l’oxydation de la plupart de la matière organique par l’utilisation de l’acide nitrique à ébullition puis la destruction des composants lipidiques de la plante en utilisant l’eau oxygénée, ainsi que la solubilisation du squelette de silicate de la plante par l’ajout de l’acide fluorhydrique.
Les échantillons séchés sont broyés finement dans un mortier. L’hydrolyse est réalisée selon le protocole de Temminghoff and Houba (Temminghoff and Houba, 2004). Un maximum de 200 mg d’échantillon est pesé et transféré dans des tubes PTFE (polytétrafluoréthylène). 2ml d’acide nitrique concentré et 0.5 ml d’acide fluorhydrique concentré sont ensuite ajoutés au matériel végétal et mélangés doucement pour humidifier l’ensemble de l’échantillon. Les tubes de digestion sont bouchés, placés dans le bloc chauffant et laissés une nuit à température ambiante. Le lendemain, les tubes sont chauffés pendant 4 heures à 110°C en ouvrant légèrement les tubes, 0.2 ml d’eau oxygénée est alors ajouté à la solution toujours chaude. Après environ 10 secondes, les tubes sont remis à chauffer. L’addition d’eau oxygénée est répétée deux fois en mélangeant. Par la suite, 1 ml d’acide nitrique concentré est ajouté. Les tubes sont replacés sur le bloc, sans être fermés complètement, et mis à chauffer pendant 4h.
Après 4h, le couvercle est ôté afin de laisser évaporer le liquide jusqu’à environ 2 ml. Le résidu est ensuite repris avec 2 ml d’acide nitrique dilué et chauffé en baissant la température du bloc pendant 5-10min, en prenant garde à ce que la solution ne commence pas à bouillir. A la fin de cette étape, le mélange est refroidi pour être enfin transféré quantitativement avec l’aide d’un entonnoir dans un tube de 15 ml en ajustant au trait de jauge avec l’eau.
5.1.2. Sols
Les échantillons de sols (3 répétitions par échantillon) sont séchés à température ambiante puis broyés finement à l’aide d’un mortier (granulométrie < 180 μM). 100 à 300 mg de sol est introduit dans des tubes PTFE et soumis à une hydrolyse acide. Les échantillons de sol sont d’abord humectés avec 0.2 mL d’eau puis dans l’ordre, 3 mL d’HCl concentré et 1 mL d’HNO3 concentré sont ajoutés. Le mélange est incubé16 heures à température
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verre au dessus de chaque tube pour le reflux. Après dissolution de l’échantillon de sol, le mélange est transféré quantitativement dans un tube de 15 mL en ajustant au trait de jauge avec l’eau distillée. En cas de dissolution partielle de l’échantillon, la solution est filtrée, puis le filtrat est repris dans une fiole de 50 mL, le filtre est rincé avec de l’eau et jaugé à 50 mL.
5.2. Détermination de la concentration en Pb
La concentration en Pb est déterminée par ICP-AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry ; Ultima2 JY) selon la méthode décrite par Margui (2005). Les échantillons (3 répétitions par échantillon) ont été analysés par la plateforme d’analyses biochimiques du CNRST (Centre National pour la Recherche Scientifique et Technique) à Rabat, Maroc.
5.3. Analyse statistique
Toutes les données sont des moyennes dues aux répétitions à l’intérieur d’une même expérience. Les données sont exprimées comme la moyenne arithmétique +/- écart type de dix individus. Les résultats ont été analysés sur le logiciel XLSTAT. L’analyse de variance a été faite avec une ANOVA à deux facteurs et des tests de Newman et Keuls avec un seuil de significativité fixé à 0,05.
Pour les plantes cultivées en sol, les données sont exprimées comme la moyenne arithmétique +/- écart type de trois mesures (3 répliquât). L’analyse de variance a été faite avec une ANOVA à un seul facteur avec un seuil de significativité fixé à 0,05 en utilisant le logiciel R V3.0.1.