Analyse d’expression des gènes candidats par QPCR

Les ARN totaux des feuilles et des racines d’H. incana ont été extraits suivant la méthode dite « au TRIzol » (Ambion).

Les tissus récoltés sont plongés dans de l’azote liquide puis réduits en fine poudre au mortier. 100 mg de tissus sont repris dans 1 mL de TRIzol dans des tubes de 1,5 ml puis incubés 5 minutes à température ambiante. Les tubes sont ensuite centrifugés 10 minutes à 12 000 rpm à +4°C pour éliminer les déchets. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube en veillant à ne pas toucher le culot. Ensuite, 200 µL de chloroforme sont ajoutés dans chaque tube. Les échantillons sont mélangés vigoureusement pendant 15 secondes, puis incubés 5 minutes à température ambiante. Après 15 minutes de centrifugation à 4°C à 12 000 rpm, la phase aqueuse est prélevée délicatement et transférée dans un nouveau tube (sans toucher l’interface blanchâtre). 500 µL d’iso-propanol froid sont ajoutés. Le mélange est incubé 10 à 30 minutes à température ambiante puis centrifugé 10 minutes à 4°C à 12 000 rpm. Le culot est dissous dans l’éthanol 75%, eau DEPC 30% puis on effectue une centrifugation 15 minutes à 12 000 rpm. Après élimination de l’éthanol, le culot est séché sous une hotte pendant quelques minutes. Ensuite, il est repris dans de l’eau DEPC, généralement 1/10ème à 1/20ème du volume TRIzol utilisé, et incubé à 55-60°C pendant 10 à 15 minutes. Les solutions d’ARNs sont congelées à -20°C pendant une nuit puis conservées à -80°C pour tout usage ultérieur.

Les ARN totaux sont ensuite quantifiés au spectrophotomètre par mesure de l’absorption à 260 nm, La contamination protéique est estimée par une lecture à 280 nm. Le rapport DO260/DO280 doit être compris entre 1,9 et 2. Un rapport inférieur à 1,9 signifie la présence de contaminants protéiques.

2. Traitement des ARNs à la DNase

Les ARN sont traités à la Turbo DNase (Ambion) selon les recommandations du fabricant : 20 µL d’ARN sont incubés pendant 1 heure à 37°C avec ajout de 1 µL de Turbo DNase,

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0,1 volume de tampon de réaction spécifique de la DNase. La DNase est ensuite éliminée par ajout de 0,1 volume de tampon d’inactivation. Après deux minutes d’incubation à température ambiante, le mélange est centrifugé 1 minute à 10 000 rpm. Les microbilles contenues dans le tampon d’inactivation fixent la DNase et les cations bivalents. Le surnageant contenant l’ARN est ensuite transféré dans un tube propre en prenant garde à ne pas toucher le culot contenant les billes, puis visualisé sur gel d’agarose et quantifiés au spectrophotomètre.

3. Réaction de transcription inverse

Un μg d’ARN total est rétro-transcrit en utilisant la Superscript III (Invitrogen) en effectuant le protocole décrit par le fournisseur :

1. Le mélange suivant est incubé 5 minutes à 65°C : 1 µg d’ARN

1 µL d’oligo (dT)20 50 µM

1 µL de dNTP

Eau DEPC, qsp 13 µL

2. Le mélange est ensuite incubé 1 minute dans la glace.

3. Ajout de :

4 µL de tampon de réaction 5X 1 µL de DTT (0.1M)

1 µL de RNaseOUT 1 µL de SuperscriptIII

Les échantillons sont incubés dans le thermocycleur pendant 50 min à 50°C (élongation du brin d’ADNc) et 15 min à 70°C (dénaturation de l’enzyme), successivement. Les ADNc synthétisés sont stockés à -20°C jusqu’à leur utilisation.

Les transcriptions inverses sont réalisées en duplicat puis rassemblées en fin de réaction pour minimiser la variabilité de la réaction.

4. Réaction de PCR quantitative (QPCR)

4.1.Principe

Après extraction des ARN totaux cellulaires, ces derniers sont transformés en ADN complémentaires (ADNc) par transcription inverse (reverse transcription, RT) lesquels sont ensuite amplifiés par PCR en temps réel. La PCR, est par définition, une réaction en chaîne au cours de laquelle des brins d’ADN néosynthétisés au cours d’un cycle d’amplification servent

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de matrice pour le cycle suivant. Un cycle de PCR est composé de 3 étapes (dénaturation- hybridation-élongation) et est répété de nombreuses fois au cours de la réaction. Ainsi, la réaction en chaîne aboutit à une accumulation exponentielle théorique de 2n fois par molécule d’ADN. Autrement dit, la quantité de produits de PCR double à chaque cycle d’amplification suivant la relation mathématique suivante :

N = N0 x 2n

(Où N est le nombre de molécules amplifiées au final, N0 le nombre initial de molécules et n

le nombre de cycles d’amplification).

Le principe de la PCR quantitative est fondé sur la détection et la quantification d’un signal fluorescent émis par un fluorophore dont l’intensité d’émission est proportionnelle à la quantité de produits amplifiés pendant la PCR. Dans notre étude, le système de détection repose sur l’inclusion d’un agent intercalant, le MESAGreen, dans l’ADN double brin. Au cours de l’hybridation des amorces puis de l’extension réalisée par l’ADN polymérase, cet agent s’intercale entre les deux brins d’ADN nouvellement synthétisés et émet une fluorescence. Cette accumulation progressive de la fluorescence est observée en temps réel à chaque cycle de PCR. Plus la quantité de cibles est importante, plus le nombre de cycles nécessaire pour atteindre une valeur de fluorescence seuil supérieure à la fluorescence du bruit de fond est faible. En effet, au cours des premiers cycles d’amplification, l’intensité de la fluorescence émise est très faible et va permettre de définir le signal de base. Après un certain nombre de cycles, l’accumulation des produits de PCR entraîne une variation mesurable de l’intensité de la fluorescence émise. Le point de départ de la phase exponentielle, phase au cours de laquelle l’efficacité d’amplification est supposée rester constante, est appelé le cycle seuil (threshold cycle, Ct). Plus précisément, le cycle seuil est le nombre de cycles pour lequel l’intensité de la fluorescence émise a dépassé une valeur seuil significativement différente du bruit de fond (Figure 14). Le Ct est inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de molécules d’ADN cible initialement présentes avant amplification par PCR (Ameziane et al., 2006). Sa valeur sera utilisée pour la quantification relative de l’ARN des gènes d’intérêt. La figure 14 décrit le principe de la PCR quantitative.

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Figure 14 : Suivi en temps réel d'une réaction PCR.

4.2. Mode opératoire

1 μg d’ARN a été utilisé pour la transcription inverse dans un volume final de 20 μL. 4 μL dilué au 1/5 de cette solution sont utilisés pour la réaction de PCR. Une réaction de PCR contient 3 μL d’ADNc, 7,5 μL de Mesagreen (Eurogentec) et 2,25 μL de chaque amorce à 2 μM. Le volume final de la réaction est de 15 μL. Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant l’appareil à QPCR, MX3005P (Agilent) et le programme suivant :

5 min à 95°C, 40 cycles de 15 s à 95°C et 1 min à 60°C

Ces cycles d’amplification sont suivis systématiquement d’un cycle appelé courbe de dissociation : 1 min à 95°C, 30s à 50°C suivi d’une augmentation constante de la température jusqu’à 95°C avec lecture de la fluorescence en continu, ceci va nous permettre de vérifier qu’il y a bien qu’un seul produit de PCR amplifié. La liste des amorces utilisées est fournie dans le tableau 11.

Tableau 11 : Amorces utilisées pour la Q-PCR à partir des ADNc d’H.incana.

Nom Amorce sens 5'‐3' Amorce Anti‐sens 5'‐3'

HiTub ATCCACTTCATGCTTTCCTC GGTAGTTGATACCGCACTTGAA

HiHMA4 CCTCATCTACTTCAACTTCTTCTC GCAGCAGTCGTGTTCTTATTC

HiMRP14 CGCCTTTAGCCTCTCGTCCT CGCTTGGGATCCTCTTTCAC

HiCNGC2 TGCTTTACCACCGGACCAAC TAGCAGTGGGTGGCAGATGA

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L’efficacité de chaque couple d’amorces a été testée en réalisant la QPCR sur une dilution sérielle de 5 en 5 des ADNc (de 1/5 à 1/15625). Celle-ci est définie comme étant la proportion moyenne des molécules d’ADN cibles se dupliquant à chaque cycle. Elle est déterminée par l’équation suivante :

Efficacité = [10(-1/pente)]-1

Une efficacité de 100% correspond à une pente de -3,32. Le gène de la tubuline a été choisi comme gène normalisateur parce qu’il a moins d’un cycle seuil (Ct) d’écart entre les différentes conditions et échantillons. Les échantillons, feuilles et racines, traités par le Pb ont été normalisés par les échantillons, feuilles et racines, cultivés en condition normale c’est à dire non traités par le Pb. L’expression relative de chaque gène a été calculée en utilisant la formule dite du ΔCt en prenant compte l’efficacité de chaque gène :

Ratio = (1+EGI) ΔCt GI/ (1+Enorm) ΔCt Norm

Où : EGI : Efficacité du gène d’intérêt

ENorm : Efficacité du gène normalisateur (tubuline)

ΔCt = Ct–Pb – Ct+Pb

5. Electrophorèse en gel d’agarose

Les ARNs sont visualisés sur gel d’agarose 1%, tampon TBE (Annexe 5) en conditions non dénaturantes. La migration se fait dans une cuve d’électrophorèse préalablement rincée au peroxyde d’hydrogène 10% pour diminuer les risques de dégradation par des RNAses (Sambrook et al., 1989). La présence de 2 bandes nettes et distinctes après révélation sous ultraviolets (UV) reflète la qualité des ARN ribosomaux majoritaires (18S et 28S) et donc, par extrapolation, la qualité des ARN totaux. Les ARN ne répondant pas à ces conditions sont exclus de toute analyse par RT-PCR.

6. Analyse statistique

Pour l’analyse les résultats QPCR, les données sont exprimées en ΔCt +/- écart type de quatre individus. L’analyse de variance a été faite avec une ANOVA à deux facteurs et des tests de Friedman et Levene avec un seuil de significativité fixé à 0,05 en utilisant le logiciel R V3.0.1.

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