Le questionnement continu de la recherche

O presente estudo identificou um grande número de proteínas presentes nas frações enriquecidas de células espermáticas das espécies estudadas. Esses dados aumentam as informações na literatura sobre a composição proteica de espermatozoides totais de ovinos, caprinos, equinos, suínos e cães, além de identificar similaridades e diferenças entre as espécies, segundo as proteínas identificadas neste estudo.

Interação de proteínas entre as espécies

Um grupo de 14 proteínas foram em expressas em pelo menos três espécies das cinco estudadas (TABELA 1). Dentre elas, a Angiotensin-converting enzyme (ACE), uma carboxipeptidase responsável pela remoção dos dipeptídeos do C terminal de substratos (Corvol et al., 1995). A angiotensina II por sua vez, é relatada atuando no desenvolvimento das espermátides e do espermatozoide maduro e regulação dos processos de capacitação e reação acrossômica (Gur et al., 1998). Segundo estudos realizados por Bromfield et al., (2015), identificaram que a ACE está localizada na região periacrossomal da cabeça do espermatozoide, representando uma peça fundamental nos processos de fertilização. Angiotensinogênio e ACE já foram identificados nos testículos de ratos, além de terem sido encontrados nas células do epidídimo, atuando na formação de angiotensina I (Cushman; Cheung, 1971). Estudos realizados com epidídimos de ratos identificaram altas concentrações de ACE quando comparados a outros órgãos do sistema reprodutor, e essa concentração aumenta após esses animais atingirem a puberdade, podendo estar relacionada de forma positiva com a produção de sêmen (Hohlbregger et al., 1982). Esta proteína (ACE) foi descrita na superfície da peça intermediária e da peça principal do flagelo de espermatozoides de mamíferos (Gatti et al., 1999; Métayer et al., 2002b), sendo ela altamente resistente a redução redox (Moskovitz; Johnson, 2004), resistindo assim ao estresse oxidativo. Ela ainda está relacionada a espermatogênese (Ayaz et al., 2018) e a forma testicular da angiotensina (TACE), tem sido relatada como uma proteína funcional a motilidade e capacitação espermática (Shibahara et al., 2001).

A ATP-synthase, que está presente como um grande complexo de proteínas que catalisam a síntese de ATP (Devenish et al., 2008). Inúmeras alterações intracelulares estão atreladas ao processo de capacitação e reação acrossômica, devido ao efluxo de colesterol que provoca aumentos na fluidez da membrana, fosforilação da tirosina e mudanças no padrão de

motilidade das células espermáticas (Eisenbach; Giojalas, 2006). No entanto, para que tais fenômenos aconteçam é necessário um consumo significativo de energia (Tulsiani et al., 2007), logo a ATP é fonte de energia para a motilidade espermática culminando ao processo de capacitação (Ruiz-Pesini et al., 2007). Ressalta-se que a produção de ATPs utilizada pelos espermatozoides é oriunda de duas vias, a glicólise e a respiração mitocondrial, sendo a primeira produzida na parte principal do flagelo, e a segunda na peça secundária, a qual representa a principal fonte de ATP utilizada pela célula espermática (Ramió-Lluch et al., 2014). Essa síntese ocorre através da catalise que ocorre a partir da transferência de íons H+ entre a subunidade Fo, que é uma subunidade transmembranar e que possui um poro de transferência para à matriz e retorna para a subunidade F1, que é a subunidade catalítica, responsável pela síntese de adenosina trifosfato (ATP). Todas as mudanças sofridas pelo espermatozoide requerem consumo significante de ATP (Tulsiani et al., 2007), sendo que existem duas principais vias para a produção de ATP na célula espermática: através da glicólise que ocorre ao longo de todo o comprimento da peça principal do flagelo e através da respiração mitocondrial, centrada na mitocôndria da peça intermediária. Desta forma, a presença das enzimas ATP synthase faz-se necessária para a síntese de ATP no espermatozoide. A glicólise é a principal via de ATP necessária para a atividade, capacitação e fertilização flagelar espermática (Mukai; Okuno, 2004), e as enzimas desse processo que estão localizadas na região da parte principal do flagelo. Isto coloca as enzimas glicolíticas e a produção de ATP ao longo da maior parte do comprimento do flagelo.

Atividades enzimáticas também exercem influência na espermatogênese por meio de enzimas mitocondriais como a citrate synthase (Ruiz-Pesini et al., 2000). O citrato é a enzima responsável pelo início do ciclo do ácido cítrico, por meio da síntese de citrato a partir de oxalacetato e acetil-CoA (Bonache et al., 2007). Estudos realizados por Novak et al. (2010), identificaram por meio de análise de regressão que embora não houvessem diferenças estatísticas nas taxas de concepção em geral, há confirmação da relação entre a síntese de citrate synthase e altas taxas de fertilidade em garanhões.

Outra proteína identificada a nível mitocondrial nesse estudo foi a cythocrome C oxidase, responsável pela transferência de elétrons do citocromo c, atuando como um facilitador na cadeia transportadora de elétrons, uma vez que por meio dessas reações e maior espaço intramembranar livre ocorre um gradiente eletroquímico através da membrana que facilita a atividade da ATP synthase em converter moléculas de ATP que serão posteriormente

utilizadas como fonte de energia para o espermatozoide. Adicionalmente, além de atuar diretamente na produção de ATP, a cytochrome C oxidase atua como antioxidante para espécies reativas de oxigênio na mitocôndria (Iaffaldano et al., 2010).

A glutathione S-transferase participa como proteína de ligação, auxiliando na interação entre gametas. De modo que o seu mecanismo de proteção específico ainda não foi muito bem elucidado (Kumar et al., 2014). Estudos sugerem que a glutatione S-transferase atue na quebra de pontes de dissulfeto que estão em volta do núcleo do espermatozoide logo após o momento de interação espermatozoide-oócito, o que resultaria na degradação das estruturas que compõe a célula e a seguinte descondensação do núcleo do espermatozoide, contribuindo para a formação do pronúcleo paterno (Hamilton et al., 2017).

A hexokinase 1, por sua vez está presente na região da peça principal do flagelo dos espermatozoides. Sua ação está relacionada a glicólise, pois a mesma sendo a primeira enzima utilizada na via glicolítica, se tornando peça fundamental no processo (Wilson, 1995). Estudos sugerem que um aumento na síntese de hexokinases resulta em aumento da glicólise e maior produção de moléculas de ATP, tendo como produto final maior motilidade para a célula espermática (Nakamura et al., 2008), além de utilizar a energia produzida para converter glicose em glicose-6-fosfato (Punyatanasakchai et al., 2008).

Estudos referentes a lactoferrin associam essa proteína a síntese em diversos tecidos, incluindo o endométrio e o epidídimo, além de estar presente no plasma seminal de garanhões (Inagaki et al., 2002). Foi identificada como biormarcador de fertilidade em elefantes, uma vez que 85% de ejaculados de elefantes asiáticos de alta fertilidade a apresentavam em sua composição (Kiso et al., 2013). Sua expressão está associada a fluidos de variados mamíferos, incluindo o plasma seminal de homens, cães, varrões, ratos e garanhões (Thaler et al., 1990; Kikuchi et al., 2003; Pearl; Roser, 2008), sendo sintetizada no epidídimo de camundongos, varrões, garanhões e nas vesículas seminais de homens (Pearl; Roser, 2008; Yu; Chen; 1993; Wichmann et al., 1989). Algumas propriedades antibióticas e antioxidantes também vem sendo associadas à lactoferrin, devido a sua capacidade de sequestrar íons ferro e dessa forma proteger os espermatozoides contra possíveis patógenos que poderiam danificar a célula espermática (Brock, 2002; Farnaud; Evans, 2003).

A proteína L-amino-acide oxidase (LAAO), geralmente é expressa na cauda do espermatozoide de animais ruminantes. No entanto estudos realizados por Aikten et al.

(2015), identificaram sua presença na cabeça do espermatozoide de equinos, auxiliando na recuperação de motilidade espermática no processo pós-criopreservação e descongelamento.

A malate dehydrogenase está presente no citosol e associadas as vias de pentose- fosfato representam a principal fonte de NADP (Clarenburg, 1992). A enzima malate dehydrogenase dependente de NADP é ativa em ambos os tipos de espermatozoides, maduros e epididimários, sendo encontradas principalmente na peça intermediária de espermatozoides de carneiros, varrões e búfalos (Mann; Lutwak Mann, 1981; Kohsakat et al., 1992) e sua localização pode estar associada aos eventos metabólicos do qual participa, dentre eles a respiração celular (Mann; Lutwak, 1981).

A pyruvate dehydrogenase atua nos processos de capacitação e reação acrossômica por meio da regulação do pH, lactato e cálcio intracelular (Mitra; Shivaji, 2004; Mitra et al., 2005). Os componentes do complexo piruvato encontram-se na peça principal do espermatozoide, viabilizando sua conversão em acetil-CoA fora da mitocôndria (Arcelay et al., 2008; Ijiri et al., 2011). Enquanto isso a proteína RAB2 atua diretamente na espermatogênese, e logo após se enovela como um componente da camada subacrossomal da teca perinuclear auxiliando na formação e desenvolvimento do acrossoma, onde permanecem nos espermatozoides maduros (Mountjoy et al., 2008).

Estudos realizados por Rickard et al. (2015), identificaram sete proteínas associadas positivamente ao congelamento de sêmen, dentre elas o sorbitol dehydrogenase. Os tecidos presentes no trato reprodutivo masculino, com exceção dos testículos, são capazes de produzir sorbitol e frutose (Kobayashi et al., 2002), onde o sorbitol pode substituir a glicose no meio utilizado para capacitação espermática, e consegue induzir um aumento de fosforilação da tirosina semelhante ao que ocorre com a glicose, além de servir como fonte de energia para processos como glicólise e a fosforilação oxidativa (Glander; Dettmer, 1978).

A succinyl-CoA catalisa as reações do metabolismo aeróbico para conversão em moléculas de ATP e CoA (Johnson et al., 1988). Essa enzima afeta a motilidade espermática e participam mais ativamente dos processos metabólicos após o processo de capacitação (Kwon et al., 2014).

Comparação do perfil proteico e filogenia entre as espécies

As frações enriquecidas de espermatozoides de ovinos e caprinos mostraram muitas proteínas em comum entre essas espécies e a sequência de algumas dessas proteínas

mostraram-se bastante semelhantes como a ATP synthase subunit α e a cytochrome c oxidase conforme mostrado na tabela 2. Essas proteínas estão mais relacionadas nas espécies ruminantes do que com as demais espécies estudadas. A ATP synthase subunit α dos espermatozoides totais de ovino mostra sequência de proteínas muito próxima em comparação a de caprino com 0,1024 quando comparada com as demais espécies estudadas (TABELA 3B).

Na tabela 2 algumas proteínas identificadas em espermatozoides totais de ovino apresentaram sequência bastante semelhantes à de outras espécies como a ATP synthase subunit α que mostrou semelhança de 90,27; 86,28 e 85,84% com sequências de proteínas de espermatozoides totais de caprino, equino e canino respectivamente. Malate dehydrogenase mostrou 92,90; 92,05 e 91,19% com sequências de proteínas de espermatozoides totais de suíno, equino e canino respectivamente. A cytochrome c oxidase também mostrou grande semelhança: 99,61 e 97,67% para sequências de proteínas de espermatozoides totais de caprino e equino. Já a hexokinase 1 mostrou poucas sequências de proteínas semelhantes entre espermatozoides totais de equino (7,76%) e cão (7,04%; TABELA 2). O estudo das proteínas contidas nos espermatozoides totais de ovinos também mostrou sequências de proteínas em comum com outras espécies como o caso da malate dehydrogenase que mostrou mais de 90% de similaridade com espermatozoides totais de cavalo, suíno e cão, assim como a succinyl- CoA também apresentou mais de 90% de similaridade para espermatozoides totais de cavalo e cão quando comparada com as sequências de espermatozoide totais de carneiro (TABELA 2). Essas informações podem ser confirmadas observando a árvore filogenética em que essas proteínas mostram-se mais relacionadas do que quando comparada com as sequências aminoácidos da mesma proteína de espermatozoides totais de bode. Podemos inferir que em algum momento as duas sequências da proteína succinyl-CoA divergiram de sua sequência em comum (FIGURA 6F, TABELA 3F).

Neste estudo, a similaridade filogenética de sequências aminoácidos de espermatozoides totais de ovinos e caprinos foi observada para algumas proteínas. Pudemos observar aproximadamente 33% de proteínas em comum para as espécies citadas. Este fato pode ser dar a presença de um ancestral comum para estas espécies. Já o suíno apresentou menor similaridade com as demais espécies estudadas (TABELA 4). Existem poucos estudos de filogenia para caprinos o que possivelmente tenha diminuído a similaridade de sequências proteicas dessa espécie com as demais. Cães apresentaram alta similaridade com ovinos (~

43% de proteínas) segundo tabela 2, o que pode ser confirmado nas árvores filogenéticas, mas vale ressaltar que para a espécie canina foi identificada um número menor de proteínas quando comparado com ovino, caprino e equino. Equinos e cães tiveram alta similaridade, com aproximadamente 43% de similaridade ente as proteínas identificadas neste estudo (TABELA 4), o que pode ser confirmado nas proteínas analisadas filogeneticamente.

Ontologia Gênica e Interactoma

Em todas as espécies estudadas as proteínas espermáticas participam de processos biológicos (processo celular, regulação e processos metabólicos) e funções moleculares (ligação e atividade catalítica), uma vez que as células espermáticas participam de eventos de maturação, capacitação espermática, reação acrossômica e processo de fertilização. Proteínas envolvidas no reconhecimento e união à zona pelúcida, inicialmente, estão inseridas de forma uniforme na membrana plasmática e como consequência de remodelações posteriores, localizam-se em domínios específicos onde se tornam funcionais. Essas mudanças resultam de diferentes mecanismos incluindo redistribuição ou desaparecimento por processamento proteolítico, ação de enzimas glicolíticas e integração de novos componentes (Okamura et al., 1992; Eccleston et al., 1994; Hunnicutt et al., 1997).

De acordo com a análise in silico, a ATP synthase subunit α interage com várias subunidades de ATPases, fornecendo energia para o funcionamento e modificações da célula espermática através da síntese de ATP (adenosina trifosfato) e ADP (adenosina bifostato).

Conforme observado na interação entre proteínas, a hexokinase 1 interage com glucose-6-phosphate isomerase, fructose-1,6-bisphosphatase 1, 6-phosphofructokinase, proteínas catalisadoras da glicólise. Em vários mamíferos, muitas enzimas glicolíticas foram identificadas na bainha fibrosa e peça principal do flagelo, como a hexokinase. Na célula espermática, as mitocôndrias estão localizadas apenas na peça intermediária, formando a bainha mitocondrial e produzindo adenosina trifosfato para a célula através de respiração aeróbica. A produção de ATP também depende de proteínas catalisadoras da via glicolítica para que ao final possa fornecer energia suficiente para a célula espermática (Travis et al., 1998).

Análise in silico da proteína pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial (PDHB) mostrou interação desta proteína com Dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), dentre outros isômeros da pyruvate dehydrogenase. O envolvimento

das enzimas metabólicas do complexo pyruvate dehydrogenase (PDHc) e sua subunidade, dihidrolipoamida desidrogenase na capacitação e fertilização de mamíferos foi relatada por Siva et al. (2014) em que PDHc e DLD foram estudadas em fertilização in vitro de hamster, onde ambas as enzimas regulariam lactato intracelular espermático, pH e cálcio. A inibição das duas proteínas provocou acúmulo de lactato, resultando na redução do pH intracelular e, eventualmente, no cálcio intracelular das células espermáticas, causando bloqueio da capacitação e reação acrossômica (Siva et al., 2012).

Succinyl-CoA 3-cetoacid-coenzima A transferase (OXCT1) mostrou interação com outras proteínas envolvidas do metabolismo aeróbico de succinyl-CoA, GDP (guanosina difosfato) ou ADP (adenina difosfato) para gerar succinato, GTP (guanosina trifosfato) ou ATP (adenina trifosfato) e CoA. A proteína succinyl-CoA pode estar relacionada à motilidade dos espermatozoides de búfalos (Huang, 2015). NADH dehydrogenase e succinyl-CoA ligase afetam a motilidade e a hiperativação de espermatozoides humanos (Ruiz-Pesini et al., 1998), portanto as enzimas observadas in silico nas redes de interação interproteica do OXCT1 teriam ação direta com a motilidade dos espermatozoides.

Angiotensin-converting enzyme (ACE-II) interage com proteína receptora de angiotensina II (AGTR1), MME e DDD4. Acredita-se que a ACE desempenhe um papel no lançamento de proteínas ancoradas a GPI (glicosilfosfatidilinositol), evento crucial para a fertilização (Kondoh et al., 2005). A ACE foi identificada em cães (Sabeur, 2001), touros, carneiros, garanhões (Gatti et al., 1999) e suínos (Willams et al., 1992), coincidindo com algumas espécies deste estudo em que esta proteína também foram identificadas.

A proteína malate dehydrogenase (MDH) foi identificada em quatro das cinco espécies estudadas, exceto em caprinos. Breininger et al. (2016) determinou a participação da enzima MDH na capacitação espermática e reação acrossômica induzidas em suínos, fornecendo energia necessária para tais processos fisiológicos em espermatozoides de suínos. Cordoba et al. (2004) também relatou importante papel da MDH no fornecimento da energia requerida para capacitação e reação acrossômica em espermatozoides criopreservados de bovinos. A proteína MDH interage com enzimas catalizadoras (Aspartate aminotransferase, Malic enzyme) de vias como fosforilação oxidativa, glicólise e metabolismo do ATP. Deste modo, foi sugerido por Leventerler et al. (2013) que a MDH tem um papel importante no metabolismo energético de espermatozoides de humanos e são importantes para a motilidade

dos mesmos, dada sua importância encontramos esta proteína na maioria dos animais estudados.