Instrumentation

Malgré les atouts du support papier, l’amplification d’acides nucléiques nécessite quelques éléments d’instrumentation. Un dispositif chauffant est employé pour atteindre la température de fonctionnement des enzymes (40˚C pour la RT-RPA ; 65˚C pour la LAMP). Le résultat d’amplification est détecté en fluorescence. Il faut donc une source de lumière UV et une caméra. Deux instrumentations sont utilisées pour les expériences sur papier. La première est une installation classique de laboratoire alors que la deuxième est une réalisation sur-mesure plus compacte et transportable.

Au laboratoire

Spécifications techniques Bien que les amplifications isothermes fonctionnent à tempéra-ture constante, le dispositif chauffant utilisé au laboratoire est un thermocycleur Peltier (MJ Research - PTC 200). Le papier est observé grâce à un macroscope Leica (Z16 APO) au gros-sissement x0.57. La détection de fluorescence est réalisée avec une source de lumière externe (Leica EL 6000) et un filtre cube Leica L5. Des images sont enregistrées à une fréquence de 1 Hz par une caméra sensible (Hamamatsu EM-CCD C900-13) avec un temps d’exposition de 75 ms. Un générateur de délai (EG R&DVision) assure la synchronisation entre l’obturateur (shutter) de la lampe UV et l’acquisition de la caméra de façon à limiter les phénomènes de blanchiment de fluorescence.

Figure 6.9 – Montage expérimental au laboratoire pour l’amplification et la détection d’acides nucléiques

sur papier.

Les propriétés optiques du filtre cube Leica L5 sont compatibles avec tous les fluorophores utilisés. Le filtre d’émission est centré à 480 nm avec une bande passante de± 20 nm. Le miroir dichroïque présente une longueur d’onde de coupure à 505 nm. Le filtre d’excitation est centré à 527 nm avec une bande passante de ± 15 nm.

6.1. Conditions expérimentales 157

Traitement d’images L’analyse d’images est réalisée avec le logiciel ImageJ. Les courbes d’amplification consistent en un suivi du signal de fluorescence au cours du temps pour chaque puits réactionnel. Une normalisation des données est obtenue par soustraction de la première image. Les fluctuations de signal dues aux conditions extérieures sont lissées avec une macro ImageJ qui prend en compte une région de l’image censée rester constante.

Dans cette configuration, l’intégralité du champ de la caméra (2 cm x 2 cm) est observé et enregistré. La mesure de chaque puits réactionnel est réalisée par une moyenne sur toute la surface d’intérêt. Mais les données brutes donnent aussi accès à des mesures locales.

En Guinée

Spécifications techniques Un dispositif sur-mesure a été développé conjointement par Mi-croFactory et R&DVision. Il réalise les mêmes fonctions de chauffage et détection de fluorescence à partir d’un équipement plus compact et transportable.

Deux LEDs bleues (Thorlabs M490L3) sont combinées à une première lentille (Thorlabs ACL25416U-A), deux filtres (Thorlabs FES0500 et Thorlabs M4R97-16) et une deuxième len-tille (Thorlabs LA1422-A) pour éclairer l’échantillon papier. Le signal de fluorescence émis est collecté par une caméra linéaire (Thorlabs LC-100) à travers une première lentille (Thorlabs ACL3026-A), un filtre dichroïque FITC (Throlabs MD499), un filtre (Thorlabs FELH0500) et une seconde lentille (Thorlabs ACL3026-A). Le papier est positionné via deux vis, sur un porte-échantillon qui est chauffé par un élément chauffant (PTC DBK HP05), contrôlé par une platine thermique (RS Components PT 1000 ohms) et une sonde de température (Carel IR33). A l’in-térieur du boîtier de contrôle de température, un circuit électronique synchronise l’allumage des LEDs avec l’acquisition de la caméra linéaire. Un schéma détaillé de cette instrumentation est présenté en figure 6.10.

Figure 6.10 – Schéma et photo de l’instrumentation optique pour un système de détection transportable.

L’ensemble de ces éléments est fixé sur une plaque d’essais optique à l’intérieur d’une valise (figure 6.11). Pendant le transport, la valise contient l’instrumentation, le boîtier de contrôle

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de température et une multiprise. Pour réaliser une expérience, il faut sortir ces deux derniers éléments et brancher l’instrumentation. Pendant l’expérience, le fait de fermer le couvercle de la valise assure des conditions d’éclairage toujours identiques.

Figure 6.11 – Photos de la valise d’expérience qui contient tout le matériel pour l’instrumentation.

Traitement d’image La caméra linéaire enregistre le signal seulement sur une ligne de pixels. Seule une fraction du dispositif papier est mesurée. Avant chaque expérience, un papier blanc faisant office de référence est mesuré. Lors de l’expérience, les mesures sont renormalisées par la référence de sorte à tenir compte de l’éclairage inhomogène.

Une macro Excel réalise l’opération de normalisation des données : soustraction de la pre-mière image et division par la référence. Les zones d’intérêt de la puce papier sont détectées automatiquement par la position du maximum d’intensité. La figure 6.12 présente les différentes étapes de traitement des données.

Figure 6.12 – Etapes du traitement de données pour la mesure de l’amplification sur papier par

l’instru-mentation transportable.

Comparaison des deux systèmes de détection

Sept dispositifs papier sont préparés : trois (papiers 1 à 3) dans la géométrie compatible avec le dispositif transportable (trois puits réactionnels rectangulaires), quatre (papiers A à D) dans le format adapté à l’instrumentation de laboratoire (quatre puits circulaires). Des expériences de RT-RPA en présence ou non de la cible ARN sont réalisées sur chaque papier. La fluorescence émise par chaque puits réactionnel sur chaque papier est mesurée par les deux

6.1. Conditions expérimentales 159

Figure 6.13 – Mesures de huit dispositifs papier par les deux instrumentations.

instrumentations. Après normalisation des données, les résultats de détection sont comparés et présentés en figure 6.13.

Dans le graphe comparant les mesures du dispositif transportable par rapport à la donnée de l’instrumentation de laboratoire, le rassemblement des points expérimentaux sur la droite y = x confirme la pertinence des mesures quel que soit le système de détection.

Outre la sensibilité des caméras et la puissance de l’éclairage UV, la différence fondamentale entre les deux dispositifs est le champ de détection. L’instrumentation de laboratoire prend une photo d’une région de 2 cm x 2 cm sur laquelle il est possible de faire des mesures locales ou moyennées sur de plus grandes surfaces. Le dispositif transportable mesure une ligne de 2000 pixels. L’éclairage autorise une ligne de détection de 1250 pixels soit environ 13 mm.

La mesure des puits de réaction est moyennée dans le premier cas sur toute la surface de papier, dans le second cas sur une ligne seulement. Si l’intensité de fluorescence est répar-tie de manière non homogène dans le dispositif papier, la détection peut être problématique (figure 6.14).

Figure 6.14 – Différentes configurations de mesures d’un signal inhomogène selon le système expérimental.

Avec l’instrumentation de laboratoire, c’est la taille et la position de la zone de mesure qui vont déterminer la valeur de l’intensité de signal. La mesure par l’instrumentation transportable dépend du positionnement vertical du papier sur le porte-échantillon.

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