Amplification d’acides nucléiques sur papier

Avant d’explorer le concept de laboratoires sur puce réalisant des tests de biologie moléculaire, les premiers essais ont consisté à vérifier la compatibilité avec le support.

Compatibilité amplification et papier

Dans la littérature, le premier exemple d’amplification d’acides nucléiques sur papier est encore à l’interface entre papier et microtube [152]. L’extrémité du papier trempant dans le tube (figure 2.20(a)) est fonctionnalisée par un microgel contenant l’ADN complémentaire d’un morceau seulement de l’ADN cible. Après contact avec l’échantillon, un second ADN est ajouté, complémentaire de l’autre extrémité de l’ADN cible. L’excès de liquide est retiré de sorte que seuls les éléments capturés par hybridation dans le papier restent dans le milieu réactionnel. Enfin, les réactifs de RCA sont ajoutés pour procéder à l’amplification isotherme du second ADN de capture. Ce dernier n’est présent que si l’ADN cible l’est aussi. Ici le papier est utilisé comme support de capture et montre la compatibilité bio-chimique entre papier et amplifications.

L’utilisation du papier seul pour l’amplification et la détection d’acides nucléiques a été réalisée dans le format des plaques multipuits papier [153] (figure 2.20(b)). Les auteurs n’ont pas eu recours à un procédé classique d’amplification isotherme mais ont développé leur propre construction moléculaire, capable de reproduire les fonctions cellulaires ribosomales. Tous les réactifs sont lyophilisés et stockés dans le papier jusqu’à réhydratation par des extraits d’ARN. Après deux heures d’incubation, le dispositif produit un signal colorimétrique ou fluorescent.

De manière à séquencer les étapes de préparation d’échantillons, d’amplification isotherme (LAMP) et de détection, des auteurs ont imaginé un système à glissières qui déplace un disque de papier dans différentes positions [154], comme le montre la figure 2.20(c). Initialement, le papier est en contact avec un papier absorbant : la pompe capillaire assure l’évacuation de tous les composés cellulaires (possibles inhibiteurs) excepté les acides nucléiques qui sont capturés par le disque de papier. Les positions suivantes plus isolées permettent l’ajout de solutions tampons, de réactifs et de l’intercalant pour l’amplification et la détection des acides nucléiques. Ce dispositif, publié en 2015, est pionnier dans le domaine de la biologie moléculaire de terrain incluant la préparation d’échantillons. Cependant, il nécessite plusieurs opérations manuelles

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Figure 2.20 – Amplification d’acides nucléiques sur papier.

et les réactifs ne sont pas prêts à l’emploi.

La grande diversité des techniques d’amplifications, des cibles biologiques et des substrats papier rend le diagnostic moléculaire sur papier compliqué à comparer. Une étude systématique très utile a été menée pour comparer cinq membranes, deux amplifications isothermes et quatre cibles biologiques [155] (figure 2.20(d)). Les expériences montrent que les données obtenues par PCR ne permettent pas de prédire les propriétés des amplifications isothermes. Cependant, une membrane en PES apparaît comme le meilleur candidat support d’amplification.

Ces quatre articles posent les bases de la biologie moléculaire sur papier. Depuis la préparation d’échantillons, la capture des acides nucléiques, la compatibilité entre amplification et substrat papier, jusqu’à la détection, toutes ces fonctions peuvent être associées au sein d’un même dispositif papier. Pourtant les exemples précédents n’exploitent presque pas la pompe capillaire et restent dans un format de disque de papier simple.

Dispositifs papiers multi-étapes

Des géométries plus originales de puces papier ont été développées pour réaliser séquentiel-lement toutes les étapes d’un test d’amplification d’acides nucléiques. Ces dispositifs utilisent le pliage comme vanne on-off et la pompe capillaire pour déplacer l’échantillon et les réactifs.

Un assemblage de papier et de plastique permet la détection d’ADN HIV par réaction RPA [156]. Le principe d’origami est exploité pour mettre en contact successivement trois épaisseurs de papier, contenant les réactifs et l’échantillon. L’utilisation pratique de ce système

2.4. Tests de biologie moléculaire sur papier 59

Figure 2.21 – Dispositifs multi-étapes pour l’amplification et la détection d’acides nucléiques sur papier.

n’est pas évidente puisque les réactifs ne sont pas stockés dans le papier. La même équipe de recherche a créé un dispositif similaire dans lequel les opérations manuelles de pipetage sont remplacées par un système coulissant [157]. L’étape d’amplification est suivie d’une migration sur test bandelettes pour une révélation visuelle du résultat d’analyse. Si ce protocole semble plus compatible avec des conditions de terrain et des opérateurs non qualifiés, l’ensemble des réactifs doit pourtant être conservé au frais avant d’être fraîchement pipeté sur le papier.

Un exemple similaire de puce papier [158] rassemble les trois étapes principales : purifica-tion d’ADN à partir d’une matrice biologique complexe, amplificapurifica-tion et détecpurifica-tion visuelle sur bandelette. Le protocole compte pas moins de dix étapes élémentaires (pliages, pipetages, décoller un adhésif plastique ...) et les réactifs ne sont pas stockés dans le papier. Mais les expé-riences sont réalisées à partir d’échantillons réels et illustrent la compatibilité d’une préparation d’échantillons sur papier avec la LAMP, même si certains prélèvements (liquide cervical) sont très invasifs.

Un dernier système [159] composé de deux bandelettes parallèles connectées sur demande illustre également la combinaison LAMP sur papier et tests bandelettes.

La figure 2.22 rassemble dans un tableau, les performances des tests d’amplification réalisés sur papier. Concernant l’échantillon biologique, sa préparation est rarement intégrée dans le

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Figure 2.22 – Comparaison des performances des dispositifs d’amplification sur papier.

dispositif papier et il s’agit souvent de brins synthétiques d’ADN. Si d’excellentes sensibilités sont atteintes avec les techniques d’amplification (LAMP, RPA, RCA et construction molécu-laire), un seul protocole permet le stockage des réactifs. L’utilisation du support papier sans équipements externes est obtenue au détriment du nombre de manipulations. Enfin, une grande variété de supports papier semblent compatibles avec la biologique moléculaire mais leur format reste très standard (disque et/ou bandelette).