2005) inhibe dans les cellules musculaire lisses la synthèse de la métaloprotéinase

(MMP9), or la perte d’ expression de MMP9 dans les neurones, est corrélée à une

absence d’expression membranaire de FasL (Kiaei et al., 2007). Il serait donc

intéressant d’évaluer le rôle de la voie RhoA/ROCK dans l’expression de la MMP9

dans les cellules B16F10 (Bianchini et al., 2006), puis d’étudier le rôle éventuel de

cette protéine dans l’expression membranaire de FasL en utilisant des ARNi.

C) CD70

Nous décrivons pour la première fois, l’expression de la molécule CD70 à la surface d’une lignée de mélanome humain et nous mettons également en évidence le rôle de la protéine RhoA dans le contrôle du niveau d’expression de CD70 dans cette lignée LB1319-MEL. En effet, nous avons observé par cytofluorimétrie une inhibition d’un facteur 3 de l’expression de CD70 dans les cellules LB1319-MEL transfectées par un ARNi spécifique de RhoA par rapport aux cellules transfectées par un ARNi contrôle. Par ailleurs, des résultats préliminaires de PCR semi-quantitative montrent une diminution du niveau d’expression de l’ARNm codant la protéine CD70 dans les cellules LB1319-MEL transfectées par un ARNi spécifique de RhoA. Ces résultats soutiennent l’hypothèse d’un contrôle transcriptionnel du gène codant la molécule CD70 par la protéine RhoA. Ils devront être confirmé par l’utilisation d’un plasmide codant le gène de la luciférase sous contrôle du promoteur de CD70 qui sera transfecté dans des cellules traitées ou non par des inhibiteurs ou des ARNi de RhoA. Ces observations nous permettent de conclure que RhoA contrôle le niveau d’expression de CD70 dans la lignée LB1319-MEL, mais ne nous permettent pas de dire que l’expression de

CD70 est uniquement sous le contrôle de la protéine RhoA. En effet, si cela était le cas, l’inhibition de RhoA inhiberait totalement l’expression de CD70. C’est pourquoi nous avons entrepris d’étudier cette lignée cellulaire l’implication de différentes voies de signalisation dans le contrôle de l’expression de CD70. Ainsi, au cours de travaux qui n’ont pas été présentés dans ce manuscrit, nous avons montré que l’activation constitutive de la voie des MAPK, induite par la mutation V600E de la protéine BRAF, contrôle également l’expression de la molécule CD70 dans ce modèle. En effet, l’inhibition de BRAF par un ARNi spécifique ou l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des protéines MEK1/2 (U0126 ; PD98059) diminue le niveau d’expression de la protéine CD70. Par ailleurs, nous avons observé que l’inhibition simultanée de la voie des MAPK et de la protéine RhoA induit une perte totale d’expression de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319-MEL. Ce résultat suggère qu’une voie de signalisation initiée par la protéine RhoA associée à une activation constitutive de la voie des MAPK, induite par la mutation V600E de la protéine BRAFV660E sont responsables de l’expression de CD70 dans la lignée de mélanome LB1319-MEL. La mutation BRAFV600E est un événement fréquent dans les mélanomes (Maldonado et al., 2003) que nous avons retrouvé dans la lignée BB74-MEL qui pourtant n’exprime pas CD70. Toutes ces observations suggèrent que l’expression de CD70 dans la lignée LB1319-MEL est dépendante de deux voies de signalisation, la première associée à l’activation des MAPK induite par la protéine BRAFV600E, la seconde initiée par la protéine RhoA. Nous émettons l’hypothèse que cette deuxième voie pourrait être dépendante de l’activation constitutive de la protéine RhoA dans cette lignée de mélanome. Afin de confirmer cette hypothèse il serait nécessaire de comparer le niveau d’activation de la protéine RhoA entre la lignée LB1319- MEL et d’autres lignées de mélanomes n’exprimant pas CD70. Cette analyse du niveau d’activation de RhoA devrait être complétée par des expériences de transfection de protéines RhoA activées (V14) dans des lignées mutées pour BRAFV600E qui n’expriment pas CD70. L’analyse de l’expression de cette molécule serait alors réalisée dans ces lignées transfectées. Il serait également intéressant de rechercher la cause de cette éventuelle activation de la protéine RhoA dans la lignée LB1319-MEL. Une activation directe par

l’intermédiaire de récepteurs pourrait être envisageable (Figure E). En effet, l’interaction entre le TNF-α et son récepteur est connue pour activer RhoA (McKenzie et al., 2007) et Castelli, C et al (Castelli et al., 1994) ont mis en évidence un taux élevé de sécrétion de TNF-α dans certaines lignées de mélanome. Il serait donc nécessaire d’évaluer la sécrétion de TNF-α produite par les cellules LB1319-MEL et de la comparer avec celle produite par d’autres lignées de mélanome n’exprimant pas CD70. Un effet indirect associé à la présence dans cette lignée de mutations susceptibles d’activer RhoA sera également évaluée. Une étude de Goel, VK et al (Goel et al., 2006) portant sur 69 mélanomes primaires a mis en évidence une perte d’expression de la protéine PTEN dans 19% de ces tumeurs. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence dans la lignée LB1319-MEL la délétion de la protéine PTEN. La perte d’expression de PTEN entraîne une activation constitutive de la PI3K qui est connue pour activer les GPTase de la famille Rho par l’intermédiaire de la protéine Vav1 (Han et al.,1998) (Liliental et al., 2000). L’expression de Vav1 est retrouvée dans les mélanomes (Bartolomé et al., 2006) et Palmby, TR et al

(Palmby et al., 2004) ont mis en évidence le rôle de cette protéine dans l’activation de la

protéine RhoA. Ainsi on peut émettre l’hypothèse qu’une activation constitutive de RhoA dépendante de la protéine Vav1 serait induite par la délétion PTEN dans cette lignée LB1319-MEL (Figure F).

Enfin, le clonage et le séquençage du promoteur de CD70 ont mis en évidence la présence d’éléments de réponse pour le facteur de transcription NFkB (Lu, Q et al p6212 2005). Plusieurs résultats montrent une diminution de l’activité transcriptionelle de NFkB associée à l’inhibition des protéines Rho (Cammarano et al., 2001 ; Montaner et al., 1998 ; Montaner

et al., 1999). Ces observations nous pousserons donc à confirmer un rôle de RhoA mais

également de la voie RhoA/NFkB dans la régulation transcriptionnelle du gène codant CD70, en particulier en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques de la voie NFkB.

Figure E :

Figure F :

II) Rôle régulateur des protéines Rho dans le

développement de la réponse immune anti-mélanome.

Comme nous venons de le discuter, l’inhibition de l’activité des protéines Rho modifie l’expression à la membrane des mélanomes de molécules connues pour prendre part à la réponse immunitaire anti-tumorale. La façon dont ces modifications influence la réponse immune anti-mélanome sera discutée dans cette partie.

II-1) Présentation des TAA par les cellules tumorales traitées :

Nous avons montré que l’expression des molécules de CMH-I et de costimulations induite par nos traitements stimule in vitro et in vivo l’activation de LT spécifiques de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la (sur)expression des CMH-I et des molécules de costimulation induite par nos traitements transforme les cellules tumorales en « CPA-like » capables d’activer par elles mêmes des LTCD8 spéficiques de la tumeur (Figure G). Cette hypothèse est en accord avec des résultats obtenus, dans des modèles tumoraux génétiquement modifiés pour exprimer des CMH et des molécules de costimulation. En effet, Bellone, M et al (Bellone et al.,1994) ont mis en évidence in vitro la capacité de cellules tumorales RMA-S génétiquement modifiées pour exprimer CD80 et présentant des peptides tumoraux dérivés du mélanome B16F10, à stimuler des LTCD8+ qui présentent alors une activité cytotoxique spécifique des cellules B16F10. De plus, dans un autre modèle tumoral, l’activation de LTCD8+ spécifiques de l’antigène tumoral P1A peut être induite in vivo, en absence de CPA compétentes pour la présentation de l’antigène P1A aux LTCD8+, après injection de cellules tumorales génétiquement modifiées pour exprimer CD80 et présentant des complexes CMHI / P1A. Dans ce modèle, la présentation des antigènes tumoraux aux LTCD8+ spécifiques de P1A et leur activation, au niveau des tissus lymphoïdes, peuvent être induites directement par des cellules tumorales métastatiques CMHI+/P1A+/CD80+ (Bai et al., 2001). Ces résultats confortent notre hypothèse suivant laquelle les cellules de mélanomes qui expriment des CMH-I et des molécules de costimulation après nos traitements in vitro

A

B

A

B