(A) L’activation lymphocytaire par des CPA professionnelles nécessitent deux signaux de stimulation. La premier délivré suite à l’interaction entre le récepteur pour l’antigène (TCR) et le complexe CMH/peptide. Le second délivré par l’interaction entre les molécules de costimulation présentes sur les CPA et leur ligands exprimés par les LT. (B) Nos traitement associant l’IFN-g et le GGTI-298 stimulent l’expression des CMH-I et des molécules de costimulation à la surface des cellules tumorales. Ces cellules se transforment alors en « CPA-like » capables d’activer une réponse immune anti-tumorale.
pourraient se comporter comme des CPA. Néanmoins l’intervention de CPA n’est pas exclue, notamment dans le cas des cellules de mélanomes exprimant uniquement des molécules de costimulation après traitement par le GGTI-298 seul. En effet, le travail de Bai et al (Bai et al., 2001) montrent ainsi que le transfert adoptif de LTCD8+ et marqués par le CFSE (carboxyl fluorescéine indiacétate succinyl ester) exprimant un TCR transgénique spécifique pour l’antigène tumoral P1A à des souris porteuses de tumeurs exprimant P1A et génétiquement modifiées pour exprimer CD80, induit une prolifération initiale des LTCD8+ spécifiques de la tumeur dans les organes lymphoïdes secondaires et non dans la tumeur. Ce résultat suggère l’intervention de CPA professionnelles capables d’induire l’activation des LTCD8+ par un mécanisme de présentation croisée.
Afin de conforter notre hypothèse sur la transformation de mélanomes traités en « CPA like » et d’exclure l’intervention des CPA, il serait nécessaire de co-cultiver les cellules de mélanome traitées avec des lymphocytes T CD8 naïfs isolés pour tester et de rechercher l’activation de LTCD8 spécifiques de la tumeur. De plus, nous pourrions tenter évaluer in
vivo la croissance des cellules de mélanome traitées dans des modèles murins compatibles
dépourvues de CPA compétentes c’est à dire déplétées en CD, macrophages ou LB.
II-2) Rôle in vivo de l’expression de FasL sur les cellules de
mélanomes:
Nous avons mis en évidence in vitro un contrôle du mécanisme de « contre-attaque » tumorale dépendant de FasL par la voie RhoA / ROCK. L’apoptose de lymphocytes exprimant la protéine Fas induite par des cellules tumorales, présentant à leur surface la molécule FasL, constitue pour ces tumeurs, un moyen d’échapper à la surveillance par le système immunitaire. Bien que ce mécanisme ait été clairement caractérisé in vitro la relevance de ce phénomène in vivo fait l’objet de controverses. En effet, des études contradictoires mettent en évidence un rôle de FasL in vivo dans la mise en place d’une réponse immune proinflammatoire anti-tumorale (Khong et al., 2002). Chen et al (Chen et
al., 1998) montrent que la surexpression du gène FasL au site tumoral entraîne le rejet
inflammatoires. Par ailleurs, Wada et al ont récemment montré que le niveau d’expression de FasL à la surface de lignées de mélanomes déterminait le type de réponse cellulaire vis à vis de la tumeur (Wada et al., 2007). Dans ce travail, il a été mis en évidence qu’un faible taux de FasL induit in vivo l’apoptose des LT et l’échappement tumoral alors que une forte expression de cette protéine favorise le rejet tumoral associé à l’infiltration de neutrophiles. En nous appuyant sur ces résultats, nous avons analysé in vivo l’effet de la surexpression de FasL, induite par l’inhibition de RhoA. Nous avons observé, au cours d’expériences préliminaires, un ralentissement de la croissance tumorale des cellules B16F10 transfectées par un ARNi de RhoA et nous avons également noté dans ces tumeurs la présence d’un infiltrat neutrophilaire important. Ces observations bien qu’encore préliminaires, nous portent à croire que comme l’ont montré Wada et al, (Wada et al., 2007) une surexpression de FasL favoriserait le rejet tumoral par l’activation d’une réponse immune inflammatoire. Afin de confirmer cette hypothèse, il serait nécessaire d’évaluer la croissance tumorale et l’importance de l’infiltrat neutrophilaire dans des tumeurs induites par des cellules B16F10 transfectées par l’ARNi de RhoA chez des souris traitées par un anticorps capable de bloquer in vivo l’interaction Fas/FasL.
II-3) Evaluation du rôle de l’expression de CD70 à la surface des
cellules tumorales dans la mise en place de la réponse immune
anti-mélanome :
Wischhusen et al (Wischhusen et al., 2002) ont montré que l’expression de CD70 à la surface de glioblastomes induit l’apoptose in vitro de LT allogéniques. Nous avons observé que l’expression de CD70 à la surface de la lignée de mélanome LB1319-MEL inhibe la prolifération de LT allogéniques. Ce résultat met en évidence un rôle de CD70 dans l’inhibition de la prolifération mais pas directement un rôle dans l’apoptose lymphocytaire que nous évaluerons ultérieurement par des tests d’apoptose spécifiques (cycle cellulaire, caspase3, AnnexineV). Diegmann et al (Diegmann et al., 2006) et al et Wischhusen et al
(Wischhusen et al., 2002) montrent que CD70 participe à la protection des cellules
tumorales vis à vis des effecteurs immuns en induisant leur apoptose. Ces résultats sont en désaccord avec les travaux précédents de l’équipe (Cormary et al., 2005) (Cormary et al.,
2004) qui montrent que l’expression membranaire ou la sécrétion de CD70 par des cellules
tumorales murines génétiquement modifiée favorise le rejet de la tumeur in vivo par activation d’effecteurs immuns. Ces résultats qui semblent contradictoires pourraient être compatibles si l’hypothèse proposée par le groupe de Michael Weller était vérifiées dans notre modèle tumoral (Aulwurm et al., 2006). Dans ce travail, ils montrent que des cellules génétiquement modifiées pour exprimer CD70 induisent in vitro l’apoptose des cellules NK tout en activant leur fonction lytique, et que ce sont ces mêmes cellules NK qui sont responsables in vivo du rejet des tumeurs exprimant CD70. Cette hypothèse est en accord avec les résultats obtenus par notre équipe qui avaient mis en évidence une implication des cellules NK dans le rejet des tumeurs génétiquement modifiées pour exprimer CD70
(Cormary et al., 2005).
L’ensemble de ces données montrent donc qu’ in vivo, l’effet immuno-stimulateur de CD70 outrepasse son effet proapoptotique favorisant ainsi une réponse immune antitumorale protectrice. Par contre, in vitro l’expression de CD70 sur les cellules tumorales induirait l’apoptose de lymphocytes mis en co-culture.
III) PERSPECTIVES
III- 1) Etude du rôle régulateur des protéines Rho dans
l’expression des CMH-II dépendante de l’IFN-γ et ses
conséquences sur la réponse immune anti-tumorale :
Au cours de travaux préliminaires nous avons observé, qu’un traitement par les statines ou le GGTI-298 inhibe l’expression des CMH-II induite par l’IFN-γ à la surface des mélanomes B16F10. Ces résultats sont en accord avec ceux déjà publiés par l’équipe de F Mach sur des lignées de monocytes/macrophages (Kwak et al., 2000). Un traitement associant l’IFN-γ et la C3 exoenzyme permettra d’évaluer l’implication des protéines Rho dans ce mécanisme. Même si l’expression des molécules de CMH-II à la surface des mélanomes favorise leur lyse par des effecteurs T CD4 cytotoxiques (Zennadi et al., 2001), Mukherji et al (Mukherji
et al., 1989) ont montré que ces molécules stimulent également l’activation de LT
régulateurs (LTreg). Ces populations participent de façon active à l’échappement tumoral, c’est pourquoi nous chercherons à savoir si l’inhibition de l’expression des CMH-II par nos traitements pourrait être associée à une diminution de la réponse des LTreg. Pour cela, la croissance tumorale de cellules traitées sera suivie dans trois types de souris de CMH compatibles : des souris sauvages, des souris scruffy dépourvues de LTreg et des souris génétiquement modifiée pour exprimer un grand nombre de cellules T régulatrices (Khattri
et al., 2003). Il sera également intéressant de rechercher la présence de LTreg
(CD4+/Foxp3+/CD25+) dans la rate et les ganglions des souris sauvages injectées par des cellules traitées par l’IFN-γ et/ou le GGTI-298 et de comparer la fréquence de ces LTreg avec celle de souris injectées avec des cellules de mélanomes non traitées.
III-2) Rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression par les
cellules de mélanome des molécules activatrices de l’immunité
innée:
Notre travail, a mis en évidence le rôle régulateur des protéines Rho dans la mise en place d’une réponse immune adaptative (LTCD8+) anti-mélanome. Cependant, plusieurs travaux montrent l’importance des effecteurs de l’immunité innée dans le contrôle du développement de ces tumeurs (Nasca et al., 1999). Les protéines murines Rae et H60 ainsi que leurs homologues humains MICA/B et ULPB sont présentes à la surface des cellules tumorales et favorisent leur élimination en activant les effecteurs de l’immunité innée les NK et les LTγδ. Des résultats préliminaires nous ont permis d’observer que le traitement par le GGTI-298 stimule l’expression de ces molécules à la surface des cellules B16F10.
Nous envisageons donc l’étude du rôle régulateur des protéines Rho dans l’expression des ligands activateurs de l’immunité innée présents à la surface des mélanomes murins et humains. Pour cela il sera intéressant d’évaluer l’expression des protéines Rae, H60, MICA/B et ULPB(123)à la surface de diverse lignées de mélanomes murines et humaines. L’implication des protéines Rho dans le niveau d’expression de ces molécules sera d’abord évaluée par des traitements à la C3exoenzyme puis avec des ARNi. Enfin l’utilisation de souris dépourvue des LTγδ ou de souris possédant des cellules NK sans activité lytique (beige) nous permettront d’aborder l’étude le rôle régulateur des protéines Rho dans la réponse innée anti-mélanome.