Le rôle de la molécule CD70 exprimée à la surface de lignées tumorales fait encore l’objet de controverses. Wichhusen et al. (Wischhusen et al., 2002) montrent que l’expression de la molécule CD70 à la surface de lignées de glioblastomes inhibe in vitro la prolifération de lymphocytes allogéniques en induisant leur apoptose, alors que des travaux réalisés au laboratoire (Couderc et al., 1998) montrent que l’expression de cette même molécule sur des lignées mélaniques murines favorisent la prolifération et l’activation lymphocytaire.
Afin d’évaluer le rôle fonctionnel de CD70 à la surface de la lignée humaine LB1319-MEL, nous avons inhibé l’expression de cette molécule par la technique de l’ARN interférant (ARNi). Pour cela, un ARNi spécifique de l’ARNm de CD70 a été conçu et sa capacité à inhiber l’expression de CD70 a été évaluée. Les résultats de cytofluorimétrie (figure 2A) et de western blot (figure 2B) montrent une diminution importante de l’expression de CD70 dans les cellules transfectées par l’ARN interférant spécifique de cette protéine (SiCD70) par rapport aux cellules transfectées par l’ARN interférant contrôle (Scramble). Ceci nous permet de valider l’efficacité de notre ARNi pour inhiber l’expression de CD70. Nous avons ensuite testé le rôle de la molécule CD70 exprimée par les cellules LB1319-MEL sur la prolifération de lymphocytes allogéniques. Après stimulation par la PHA (un mitogène polyclonal
induisant la prolifération des LT) des PBMC allogéniques de donneurs sains ont été cocultivés pendant 72h en présence de cellules LB1319-MEL tranfectées soit par un ARNi contrôle (scramble) soit par l’ARNi dirigé contre CD70. La prolifération des PBMC a été évaluée par incorporation de methyl thymidine trititée. L’incorporation de methyl thimidine tritiée est plus importante dans les PBMC cocultivés en présence de cellules transfectées par l’ARNi dirigé contre CD70 qu’en présence de cellules transfectées par un ARNi contrôle (figure2C). Cette observation met donc en évidence une inhibition de la prolifération lymphocytaire par la protéine CD70 exprimée à la surface de la lignée LB1319-MEL.
RhoA contrôle l’expression de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319- MEL :
Les travaux récents menés dans l’équipe montrent que les protéines Rho contrôlent l’expression de la molécule FasL à la surface de la lignée mélanique murine B16F10. CD70 étant comme FasL une molécule de la famille des TNF nous avons cherché à savoir si son expression à la surface de la lignée LB1319-MEL, pouvait être régulée par les protéines Rho. Pour cela nous avons traité les cellules LB1319-MEL par la C3 exoenzyme, une toxine produite par la bactérie Clostridium botulinum. Cette enzyme est connue pour inhiber de façon spécifique l’activité des protéines RhoA, RhoB et RhoC par le mécanisme d’ADP ribosylation. Les résultats présentés sur la figure 3A montrent que le traitement par la C3 exoenzyme diminue l’expression membranaire de CD70 d’un facteur 2. Cette expression étant analysée par cytofluorométrie et quantifiée par l’Index Spécifique de Fluorescence (ISF) (cf Matériels et Méthodes). De plus, par western blot nous avons vérifié l’efficacité de l’enzyme C3 à ADP ribosyler la protéine RhoA dans notre modèle tumoral (figure 3A). Comme nous le montre la figure 3A on observe la présence de deux bandes sur les extraits provenant des cellules traitées par la C3 alors qu’une seule bande n’est visible sur les extraits provenant de cellules non traitées. La bande du haut correspond aux protéines RhoA ayant déjà subit l’ADP ribosylation (inactivées) et celle du bas aux protéines RhoA non ADP ribosylées. Cette analyse confirment donc, l’efficacité de notre traitement. Les résultats obtenus précédemment montrent que l’expression de CD70 à la surface des cellules
LB1319-MEL est diminuée par la C3 exoenzyme utilisée pour inhiber les protéines RhoA, B, C. Les protéines Rho régulent donc positivement l’expression de CD70 dans cette lignée de mélanome huamain.
Afin de caractériser de façon plus précise laquelle de ces trois protéines Rho joue un rôle dans l’expression de CD70, nous avons choisi d’utiliser la technique des ARNs interférants (ARNi). Les cellules LB1319-MEL ont été transfectées par des ARNis spécifiques des ARNm codant les protéines RhoA, RhoB ou RhoC ou par un ARNi non fonctionnel (scramble : séquence aléatoire avec les mêmes nucléotides). 72 heures après la transfection les cellules LB1319-MEL ont été repiquées. 24h après le repiquage une partie des cellules a été lysée afin d’évaluer par western blot l’efficacité des ARNis, dans nos conditions et notre modèle tumoral, à inhiber spécifiquement les protéines Rho (figure 3B). De plus, 48h après le repiquage nous avons évalué par cytofluorimétrie le niveau d’expression de CD70 à la surface des cellules traitées (figure 3C). L’analyse par western blot présentée sur la figure 3B montre que les ARNis dirigés contre les protéines RhoA et RhoB inhibent de façon spécifique leur cible sans modifier de façon significative l’expression des autres protéines Rho. Nous n’avons pas pu évaluer l’efficacité du ARNi dirigé contre RhoC par manque d’anticorps spécifiques dirigés contre cette protéine. Après avoir démontré l’efficacité de nos ARNis, nous avons évalué l’effet de l’inhibition des différentes protéines Rho sur l’expression membranaire de CD70. Sur l’histogramme de la figure 3C on observe que seul le ARNi de RhoA diminue l’expression de la molécule CD70 à la surface des cellules LB1319-MEL. L’inhibition de l’expression de CD70 dans des cellules transfectées par l’ARNi de RhoA a également été mis en évidence par western blot (figure 3D). Ainsi, l’ensemble de ces observations met en évidence dans la lignée LB1319-MEL, un rôle régulateur positif de la protéine RhoA sur l’expression totale de la molécule CD70.
Discussion
En situation physiologique normale, la molécule CD70 joue un rôle prépondérant dans la mise en place d’une réponse immune efficace. Cette molécule est présente sur plusieurs lignées lymphoïdes et son expression à la surface de lignées tumorales est souvent
associée à un mauvais pronostic de la maladie. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes intervenants dans la régulation de la réponse immune anti-tumorale et nous disposons au laboratoire de plusieurs lignées de mélanomes humains.
Nous avons recherché l’expression de la molécule CD70 à la surface de différentes lignées mélaniques humaines. Nous avons clairement mis en évidence qu’une seule de nos lignées exprime de façon constitutive la molécules CD70 ; il sagit de la lignée LB1319-MEL. L’analyse par western blot nous montre que cette lignée exprime les trois formes (monomériques, dimériques et trimériques) de la molécule décrites dans la littérature.
Nous avons voulu évaluer la capacité des cellules LB1319-MEL à développer un mécanisme de contre-attaque tumorale dépendant de la molécule CD70. Le mécanisme de contre- attaque tumorale est généralement associée à l’expression de FasL à la surface des cellules tumorales, c'est-à-dire la capacité de certaines cellules tumorales «à « attaquer » les effecteurs de la réponse immune exprimant le récepteur Fas et à induire leur mort par apoptose. Les travaux de l’équipe de Wischusen ont mis en évidence un mécanisme de contre attaque tumorale in vitro impliquant la molécule CD70 dans un modèle de glioblastome (Wischhusen et al., 2002). Il a été montré que des lignées de glioblastomes positives pour CD70 inhibent la prolifération de lymphocyte allogéniques en induisant leur apoptose par contact entre la molécule CD70 et son récepteur CD27 présent sur ces lymphocytes.
Afin d’analyser par des techniques de cocultures (lymphocytes / tumeurs) l’effet de CD70 sur la prolifération et l’apoptose lymphocytaire, nous avons bloqué l’expression de cette molécule par la technique de l’ARN interférent (ARNi), pour comparer les résultats obtenus avec des tumeurs exprimant ou non la molécule CD70. Nos résultats montrent une diminution de la prolifération des lymphocytes allogéniques associée à la présence de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319-MEL. Cette observation met en évidence un effet de CD70 sur la prolifération lymphocytaire mais ne permet pas de conclure qu’il sagit d’un mécanisme d’apoptose lymphocytaire. C’est pourquoi, nous proposons d’évaluer par des tests spécifiques (Annexine V, SubG1, Clivage de la caspase 3) l’effet de CD70 sur l’apoptose de PBMC totaux ou de lymphocytes T exprimant le récepteur CD27. Ces
cellules, préalablement traitées à la PHA, seront cocultiveés en présence de cellules LB1319-MEL transfectées soit par un ARNi contrôle ou par un ARNi spécifique de CD70 et des tests d’apoptose seront réalisés.
Comme nous l’avons dit précédemment CD70 appartient à la famille des TNF comme la molécule FasL. Des travaux menés au laboratoire montrent que la protéine RhoA inhibe l’expression membranaire de la protéine FaL à la surface de la lignée de mélanome murin B16F10 (Sarrabayrouse et al., 2007). En utilisant la C3 exoenzyme connue pour inhiber l’activité des protéines Rho (RhoA, RhoB, RhoC, Rac, Cdc42) nous avons mis en évidence que ces protéines contrôlaient le niveau d’expression de CD70 à la surface des cellules LB1319-MEL. Nous avons cherché l’implication de chacune des protéines RhoA, B et C dans la régulation de l’expression de la molécule CD70. Pour cela, nous avons optimisé l’utilisation de la technique des ARN interférents sur les cellules LB1319-MEL. Cependant, l’efficacité et la spécifiité du siRhoC n’ont pu être visualisées faute d’anticorps spécifiques. C’est pourquoi l’étude de l’effet du siRhoC sera entreprise ultérieurement par la technique de RT-PCR quantitative. Par contre, l’efficacité et la spécificité des Si RhoA et RhoB ont été vérifiées dans notre modèle. Nous avons montré par cytométrie de flux que l’expression membranaire de CD70 diminuait d’un facteur trois en comparaison à celle observée pour le contrôle et ceci uniquement lorsque les cellules LB1319-MEL étaient transfectées par l’ARNi spécifique de RhoA. De plus, l’analyse par Western Blot du taux global cytoplasmique et membranaire d’expression de CD70 après inhibition spécifique de RhoA a permis de constater que le taux global de la protéine CD70, était diminuée dans les cellules transfectées par l’ARNi spécifique de RhoA. Cette observation met en évidence un rôle régulateur positif de RhoA dans l’expression du taux global de la protéine CD70 et non pas un rôle de régulateur négatif de son expression membranaire comme nous l’avons démontré pour une autre protéine de la famille des TNF :FasL. De plus, ce résultat suggère un rôle de RhoA dans la régulation transcriptionnelle ou traductionnelle de la protéine CD70.
Des résultats préliminaires de RT-PCR semi-quantitative montrent une diminution du niveau d’expression de l’ARNm codant la protéine CD70 dans les cellules LB1319-MEL transfectées par l’ARNi spécifique de RhoA. Ce résultat conforte l’hypothèse d’un contrôle transcriptionnel
du gène codant la molécule CD70 par la protéine RhoA et devra être confirmé par l’utilisation d’un plasmide codant le gène de la luciférase sous contrôle du promoteur de CD70. Par ailleurs, le clonage et le séquençage du promoteur de CD70 ont mis en évidence la présence d’éléments de réponse pour le facteur de transcription NFkB. Or, plusieurs travaux ont décrit une diminution de l’activité transcriptionelle de NFkB associée à l’inhibition des protéines Rho (Cammarano et al., 2001 ; Montaner et al., 1998 et 1999). Des expériences seront donc entreprises pour étudier le rôle éventuel de RhoA mais également de la voie RhoA/NFkB dans la régulation transcriptionnelle du gène codant CD70.
Figure 1 : La lignée de mélanome humain LB1319-MEL exprime de façon constitutive la molécule de costimulation CD70
Les différentes lignées mélaniques humaines (LB1319-MEL, LB283-MEL, LB1829-MEL, BB74-MEL, LB2033-MEL) sont cultivées pendant 48h en milieu complet. L’expression de la molécule CD70 est évaluée par les courbes obtenues en cytofluorimétrie (A). L’expression de la molécule CD70 à la surface de la lignée LB1319-MEL a également été illustrée par immunofluorescence (B). (C, D) Les cellules B16F10CD70 (modifiées génétiquement pour exprimer la molécule CD70 humaine), B16F10WT et LB1319-MEL sont cultivées pendant 48h en milieu complet. L’expression de la protéine CD70 (C) ou de l’ARNm (D) de la molécule CD70 sont ensuite évaluées respectivement par western blot (C) ou RT-PCR (D).
Figure 2 : Evaluation du rôle de la molécule CD70 exprimée par la lignée LB1319-MEL ,dans la prolifération de PBMC allogéniques
(A)(B) Un ARN interférant dirigé contre la protéine CD70 a été conçu et son efficacité à inhiber l’expression de la molécule CD70 a été évaluée par western blot (A) ou cytométrie de flux (B). Des cellules LB1319-MEL ont été transfectées par un ARNi spécifique de CD70 ou un ARNi contrôle. Ces cellules ont ensuite été cocultivée pendant 48h avec des PBMC de donneurs sain allogénique prétraités à la PHA. De la méthyl-3H thymidine est ajoutée pendant 24h à raison d’un micro Ci par godets, puis l’incorporation de thymidine est analysé à l’aide d’un compteur béta (C).
Figure 3 : RhoA régule l’expression de la molécule CD70 dans la lignée LB1319-MEL
Les cellules LB1319-MEL sont traitées à la C3 exoenzyme pendant 48h l’expression membranaire de CD70 est analysée par cytofluorimétrie, les résultats sont exprimés en indice de fluorescence (A) et le niveau d’ADP ribosylation de la protéine RhoA est évalué par western blot (A). Les cellules LB1319-MEL sont tranfectées par un ARNi contrôle (Sc) ou par des ARNi spécifiques de RhoA (SiA2), RhoB (SiB2), ou RhoC (SiC2). La diminution d’expression de ces protéines est testée à J4 après la transfection par western blot illustré par B. A J5 l’expression de la molécule CD70 est évaluée soit par cytofluorimétrie (C) soit par immunoempreinte (D). Pour A et C, les moyennes et les écarts- types sont calculés à partir d’au moins 3 epériences indépendantes.