CHAPITRE 3 : L’ISCHEMIE REPERFUSION
F. Inflammation
La barrière isolante que constitue l’endothélium dans les conditions physiologiques normales est altérée au cours de la séquence d’IR et devient ainsi perméable aux cellules de l’inflammation. Plusieurs mécanismes peuvent être en cause : perte de jonction entre les cellules endothéliales, détachement de ces cellules exposant le tissus sous jacent, ou atteinte du glycocallix à la surface de ces cellules.
Dans un modèle d’auto-transplantation de rein de porc, notre équipe a mis en évidence une infiltration de monocytes/macrophages dans le compartiment interstitiel qui augmentent progressivement dans le rein durant les deux premières semaines post-transplantation qui est suivie par une infiltration de lymphocytes T CD4+ et CD8+ [178-181]. D’autres travaux ont confirmé ces faits. Les différentes cellules impliquées ainsi que les différents médiateurs sont représentés dans la figure 13.
Figure 13 : Représentation de la réponse immune précoce après reperfusion rénale détaillant
les principaux acteurs impliqués dans la réaction inflammatoire contemporaine de l’ischémie reperfusion [178].
1.Le processus d’infiltration des cellules inflammatoires
dans le tissu lésé
Des leucocytes circulants, essentiellement des polynucléaires neutrophiles (PNN) et des macrophages, activés par différents facteurs locaux tels que les cytokines ou les EOR, expriment des molécules d’adhérence à leur surface facilitant leur adhérence à l’endothélium activé.
La séquence d’IR dans le tissu rénal est responsable de lésions des cellules endothéliales caractérisées par un gonflement cellulaire et d’une surexpression de molécules d’adhérence telles que Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) ou Vascular Cell Adhesion Molecule- 1 (VCAM-1), les intégrines et les sélectine E, P et L [182]. Elles permettent alors de diminuer le « Rolling » leucocytaire et un attachement lâche. Les cytokines (produits d’activation du complément, facteur d’activation des plaquettes…) permettent un attachement solide des leucocytes à la paroi endothéliale afin que les intégrines puissent faire migrer le leucocyte activé entre les cellules endothéliales comme il est décrit figure 14 (diapédèse).
Puis les leucocytes participent à l'extension des lésions par la dégranulation dans l’interstitium de vésicules contenant des cytokines comme le TNF- alpha ou l’Il-1 [183], leucotriènes et thromboxane, et libèrent des enzymes protéolytiques telles que la collagénase ou l’élastase ainsi que des EOR entraînant des lésions de la matrice protéique et des lésions irréversibles du tissu [60].
Les macrophages semblent impliqués dans le processus fibrosant [184] et leur fonction pourrait varier au cours de la reperfusion [185, 186]. Finalement, l’activation du couple endothélium leucocytes est à l'origine d'une extension des lésions d'IR.
Figure 14 : Schéma représentant les mécanismes moléculaires déclenchés au moment de la
reperfusion [187].
L'infiltrat lymphocytaire s'installe secondairement, son rôle et sa physiopathologie sont encore mal compris [179]. Le lymphocyte T pourraient participer à l’amplification de la reconnaissance antigénique ou à l’inverse, pour certains phénotypes avoir un effet protecteur [188, 189]. Le rôle des lymphocytes B a été étudié et ces cellules semblent avoir un rôle mineur dans la pathogénie de l’IR [178, 190].
2.Le complément
Le rein lui-même est une source importante de composés du complément. Un récent travail expérimental a suggéré qu’une synthèse locale de complément a un important effet sur les dommages tissulaires en transplantation rénale [191], et que la production locale dans le rein est augmentée en réponse aux lésions de l’IR [192]. C5a est un composé du complément qui contribue à l’infiltration des neutrophiles dans le rein [193, 194].
3.Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrice d’antigènes qui participent à la tolérance du « soi » et à l’activation de l’immunité acquise. L’hypoxie a été impliquée dans la maturation des cellules dendritiques [195]. Les cellules dendritiques et leur activation via la production des EOR constituent un lien entre l’IR et l’immunité innée. Suite à l’engagement des récepteurs Toll-like [196, 197], ces cellules deviennent actives et matures avec une modification de l’expression de leurs récepteurs de surface conduisant à leur migration vers les organes lymphoïdes secondaires [196]. Les cellules dendritiques deviennent alors capables de stimuler les lymphocytes T naïfs. Il s’ensuit une augmentation de production et d’expression de nombreuses protéines pro inflammatoires (cytokines et chémokines et leurs récepteurs).
4.Les cellules épithéliales participent à l’inflammation
Les cellules proximales tubulaires sont des effecteurs de l'inflammation connus depuis peu [198]. En effet, lors des lésions d'IR ou en présence de TNF-α, elles secrètent de nombreuses cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-1β et TGF-β) ainsi que des chémokines (MCP-1, IL-8) [199]. De plus, la cellule proximale tubulaire exprime le CD40, récepteur du CD154 (CD40-ligand) présent à la surface des lymphocytes T et des plaquettes.
In vitro, la reconnaissance CD40-CD154 entraîne une augmentation de la synthèse du MCP-1
et de l’IL-8 par la cellule tubulaire proximale [200].
5.Le Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH)
Les défenses immunitaires de l’organisme vis-à-vis des agents pathogènes et des cellules malignes reposent en grande partie sur la surveillance par les lymphocytes T cytotoxiques. Cette surveillance est rendue possible par un système d’apprêtement des protéines cellulaires, qui fournit des échantillons peptidiques au CMH exprimé à la surface cellulaire.
Lors de la reperfusion, il existe une surexpression des molécules CMH de classe II au niveau des cellules endothéliales et interstitielles du greffon, et de classe I au niveau des cellules tubulaires, ce qui entraîne une augmentation de l’immunogénicité de greffon [201- 203].
Les antigènes du CMH peuvent initier une forte réponse immunitaire via une
reconnaissance directe des molécules du CMH en surface des cellules du greffon et de manière indirecte par la reconnaissance de peptides dérivées de ces molécules et présentées au système immun du receveur au travers des cellules présentatrices d’antigène (CPA) [204, 205].
a.Localisation
On distingue le CMH de classe I qui est exprimé en surface de toutes les cellules et présente aux lymphocytes T CD8+ des peptides (8 à 10 acides aminés) dérivés d’antigènes endogènes principalement. Le CMH de classe II est exprimé à la surface des CPA uniquement et de façon anormale à la surface des cellules endothéliales activées. Il présente aux lymphocytes CD4+ des peptides dérivés d’antigènes exogènes.
b.Rôles des différents CMH selon leur ligand
Les CPA ne peuvent présenter efficacement leurs peptides antigéniques qu’à partir du CMH du « soi ». Dans le cas des allogreffes rénales, les présentations antigéniques se font à partir du CMH du « soi » sur les CPA du receveur mais également à partir du CMH du non « soi » sur les cellules épithéliales du donneur qui les expriment anormalement. Ces dernières sont alors considérées par les lymphocytes T du receveur comme des éléments à éliminer. Il y a une réaction de l’immunité du receveur versus le greffon.
c.CMH de classe II et antigènes exogènes
Les molécules de classe II sont spécialisées dans la fixation de peptides provenant d'antigènes exogènes, internalisés depuis l'environnement extracellulaire par endocytose. Les protéines exogènes intègrent successivement les différents compartiments de la voie endocytique où elles sont dégradées par diverses enzymes protéolytiques. En effet, les protéines nécessitent un apprêtement intracellulaire générant des peptides capables de s'associer aux molécules du CMH de façon efficace.
d.CMH de classe II et antigènes endogènes
Cette voie semble utilisée uniquement dans l’expression anormale des molécules de CMH de classe II :
Soit l’endosome tardif fusionne avec les vacuoles ;
Soit il y a une translocation directe de protéines du cytoplasme vers le compartiment contenant les CMH de classe II.
e.CMH de classe I et antigènes exogènes
Dans ce cas là, l’antigène doit être internalisé par la CPA. S’il se retrouve, par un quelconque mécanisme, dans le cytosol, alors il suivra le même chemin d’apprêtement que pour l’apprêtement d’un peptide endogène. S’il ne se retrouve pas dans le cytosol, alors le mécanisme d’apprêtement doit ressembler à celui du CMH de classe II avec les peptides d’origines exogènes [206].
f.
CMH de classe I et antigènes endogènes (TAP-1,
TAP-2, Tapasine et β 2-microglobuline)
Les antigènes endogènes peuvent avoir différentes origines [207] : les protéines normales de la cellule, les protéines de la cellule altérée, ou encore les protéines d’un pathogène intracellulaire. Ils sont dégradés principalement par les protéasomes cytosoliques grâce à leur fonction carboxypeptidase en petits peptides de 8 à 16 acides aminés comme décrit figure 15 [207].
Il semble que beaucoup de peptides générés soient perdus avant d’être capables d’être associés au complexe de transport membranaire du réticulum endoplasmique (RE). En effet, ils sont dégradés par les peptidases présentes dans le cytosol [206].
L’apprêtement commence par la traduction de la sous-unité α du CMH de classe I par un ribosome fixé à la membrane du RE. Afin de stabiliser cette sous-unité dans la lumière du RE, elle est également fixée à une protéine transmembranaire, la calnexine. L’association des chaînes lourdes avec la β 2-microglobuline (deuxième sous unité du CMH de classe I) est accompagnée par le remplacement de la calnexine par la calréticuline. Ensuite, grâce à la molécule ERP 57, le complexe CMH de classe I est stabilisé. Quelques peptides parviennent à se lier au complexe Transport Antigen Processing (TAP)-1 et -2 de la membrane du RE et ce n’est que par consommation d’ATP qu’ils la traverseront pour la lumière du RE [207].
Les peptides pourront être encore digérés par des peptidases présentes dans la lumière du RE afin d’atteindre une taille de 8 à 10 acides aminés, taille plus adaptée à leur fixation au CMH de classe I.
Deux possibilités sont alors envisageables :
Soit le peptide a une affinité sub optimale : la Tapasine maintient alors le complexe sur le système de transfert TAP, jusqu’à ce que se fixe le peptide le plus adapté à sa conformation ;
Soit le peptide est adapté au complexe. La consommation de deux ATP permet la libération du complexe, du système TAP, ainsi que de la Tapasine et de la calréticuline.
Les complexes ainsi formés se regroupent pour suivre la voie de sécrétion constitutive de la cellule, c'est-à-dire passer par l’appareil de Golgi et enfin être exprimés en surface [206].
Figure 15 : Représentation de l’apprêtement des antigènes et complexes de chargement du
CMH de classe I.
L’apprêtement peptidique du CMH de classe I passe par un complexe de sous-unités composées de la manière suivante : un hétérodimère de TAP1 et TAP2 est associé à 4 tapasines, 4 calréticulines, et 4 dimères de CMH de classe I / β 2-microglobuline [208].
g.β 2-microglobuline (β 2-m)
Identifiée en 1964, la β 2-m est un peptide globulaire de petite taille (environ 12kDa), qui fait partie de la famille des Immunoglobulines G (IgG). Elle est associée au CMH de classe I présent en surface cellulaire mais elle peut aussi se trouver sous forme soluble dans les liquides biologiques. La dégradation de la β 2-m se fait exclusivement dans les reins. Elle est filtrée par la membrane glomérulaire, puis résorbée presque totalement au niveau du tubule proximal. Selon plusieurs publications, des taux sériques élevés de β 2-m ont été observés en cas de maladies rénales comme les glomérulopathies, les tubulopathies, l’insuffisance rénale et l’amyloïdose.
h.Les transporteurs associés au processus
antigénique (TAP)
TAP est un membre de la famille des transporteurs « TAP binding cassette » (ABC transporters) [209]. Les gènes de TAP-1 et TAP-2 sont retrouvés dans la région du CMH de classe II présent sur le chromosome 6 humain.
Les protéines TAP sont composées d’un domaine hydrophobe comprenant de multiples segments transmembranaires et un domaine hydrophile de liaison aux nucléotides. Ce dernier est un motif hautement conservé qui permet l’hydrolyse de l’ATP [210].
L’hétérodimère TAP transporte les peptides du cytosol à la lumière du RE en consommant de l’ATP. TAP-1 et TAP-2, seuls ne peuvent lier les molécules du CMH de classe I [211].
TAP fonctionne avec différentes tailles de peptides et des séquences spécifiques : le transport est idéal pour des tailles de peptides de 9 à 12 acides aminés même si de plus longues tailles peuvent être transportées [212]. Les peptides transportés sont générés par le protéasome dans le cytosol, pourtant des peptides générés d’une autre manière peuvent aussi être transportés [213, 214].
Un récent travail utilisant une étiquette fluorescente sur les chaînes TAP, a permit de faire une estimation de la mobilité du complexe TAP sur la membrane du RE et a permit de mettre une nouvelle lumière sur la fonction de TAP [215]. La mobilité latérale de TAP sur le RE de cellules vivantes augmente quand TAP est inactive et décroît quand les peptides transloquent.
En utilisant cette approche, il a été proposé que normalement seulement un tiers des molécules TAP transportent activement des peptides. Cependant l’activité de TAP augmente en parallèle de l’infection virale. Dans ces expériences, il a été démontré que la source de substrats extérieurs provenait de produits de ribosomes défectueux [216].
Une observation supplémentaire a mit en évidence que les peptides destinés à TAP mais non transportés font aussi décroître la mobilité de TAP. Ceci suggérait qu’un peptide induit un changement conformationnel de TAP indépendamment de la translocation de ce peptide [217]. Cette notion est confirmée par des expérimentations montrant que les peptides ou les nucléotides pourraient initier différentes conformations de TAP [218].
En utilisant des mutants de TAP qui étaient incapables de fixer l’ATP, Knittler et coll. démontrèrent que :
• Le transport peptidique nécessite une liaison nucléotidique aux deux sous-unités TAP
• Le peptide entraîne le détachement de TAP des complexes CMH de classe I et β 2- microglobuline, ce qui nécessite une liaison nucléotidique mais pas d’hydrolyse d’ATP (quand le peptide était additionné de manière exogène)
• La liaison nucléotidique est nécessaire pour que le peptide soit lié à TAP.
Ils conclurent alors que le peptide est à l’origine du détachement du CMH de classe I / β 2- microglobuline de TAP, ce qui est initié par un changement conformationnel de TAP, nucléotide dépendant.
Le travail utilisant les mutants de TAP a modifié la liaison à l’ATP mais pas l’hydrolyse de celui-ci ce qui confirme que les sous-unités TAP ont aussi un rôle distinct du transport peptidique tel que l’hydrolyse de l’ATP par une chaîne, induit la liaison de l’ATP à l’autre chaîne et que le peptide initie le détachement du CMH de classe I de TAP est lié a un signal conformationnel de l’occupation de l’ATP sur TAP-1 [219].
Ils démontrèrent que TAP-1 et TAP-2 ont des propriétés distinctes face à l’ATP. Ainsi la liaison de l’ATP à TAP-1 est l’étape initiale du processus de transport peptidique[219].
i.
Tapasine
Ce travail montra que les lignées cellulaires ne possédaient pas de tapasine, une protéine de 48kDa qui stabilise le complexe CMH de class I / β 2-microglobuline avec TAP [221].
Tapasine est une protéine chaperonne transmembranaire de type I qui réside dans le RE et qui est codée par la grande région du CMH de classe II sur le chromosome 6 humain. La structure de cette molécule est composée d’un simple site de glycolsylation, d’une séquence d’adressage au RE ce qui provoque son maintien ou sa récupération dans cette zone et un domaine apparenté aux immunoglobulines [222].
Les investigations suivantes ont suggérés que tapasine était impliqué dans plusieurs aspects de l’assemblage du CMH de classe I. En plus de créer un pont entre l’hétérodimère CMH de classe I / β 2-microglobuline et TAP, tapasine augment le niveau de TAP [223], initie la liaison peptidique par TAP [224] et facilite l’incorporation des autres chaperonnes au complexe multimoléculaire d’apprêtement peptidique avec l’interface de TAP.
6.Les Toll Like Receptors (TLR) et notamment TLR2 et
TLR4
a.L’immunité innée
Le concept d’immunité innée fait référence à la première ligne de défense mise en place très rapidement et transitoirement mais de manière non spécifique, lors d’une infection ou d’un stress ayant conduit à des nécroses cellulaires [178, 197].
Plusieurs mécanismes la composent :
•La phagocytose qui implique les macrophages et monocytes ;
•La libération de peptides antibactériens, d’intermédiaires oxydatifs dont le NO, OH°, etc ;
•La cytotoxicité naturelle des cellules NK en présences de cellules infectées ou tumorales.
Les récepteurs de l’immunité innée sont dénommés pattern recognition receptors (PRRs) et reconnaissent des structures communes à des groupes de pathogènes : les pathogen associated molecular pattern (PAMP) [225]. Les PRRs sont divisés en quatre familles dont les toll-like receptors (TLRs).
b.Les TLRs :
Chez l’homme et les mammifères en général, il a été découvert onze TLRs différents, néanmoins TLR2 et 4 sont les plus connus [226]. Le premier TLR identifié chez les mammifères a été le TLR4 en 1997 [227, 228].
Leurs fonctions principales sont de détecter la présence et le type de pathogènes, de déclencher une réponse locale (la réponse immunitaire innée [229]) et de stimuler la réponse adaptative antigène spécifique [230]. Grâce à eux le système immunitaire différencie le pathogène du « soi », avant même que les autres systèmes de défenses, plus complexes, se mettent en place.
c.Localisation
Les TLR sont des protéines transmembranaire surtout présentes au niveau de cellules impliquées dans l’immunité telles que les macrophages et cellules dendritiques, mais aussi au niveau des cellules tubulaires rénales lors d’IR [231]. TLR2 et TLR4 sont exprimés à la surface des cellules : TLR2 est associé en hétérodimères et TLR4 en homodimères.
L’Acide Ribonucléique messager (ARNm) de TLR2 et 4 sont produits de manière constitutive sur les cellules épithéliales tubulaires proximales et distales. Nous retrouvons ces protéines sur le pôle apical de ces cellules. Lors d’un stress tel qu’une inflammation rénale,constate une augmentation de leur ARNm dans les cellules tubulaires distales principalement, mais aussi dans la branche fine de l’anse de Henlé et dans les cellules des tubes collecteurs [232].
La protéine TLR2 est aussi trouvée sur les membranes cellulaires endothéliales, dans tout le rein et sur les capillaires péritubulaires ainsi que les artérioles [233]. Son expression est initié sur ces cellules lors des dommages de l’ischémie [232]. La signification fonctionnelle de cette surexpression, cependant, reste à ce jour inconnu.
d.Les différents ligands
Les TLRs sont des récepteurs hautement conservés qui ont été impliqués dans la réponse immune d’une grande variété de pathogènes. Ils détectent des composés microbiens exogènes (PAMP) et les DAMP (ligands endogènes) [234] qui sont des molécules qui signalent un
En effet, il y a quelques années, il est devenu clair que les TLRs reconnaissent aussi du matériel endogène de l’hôte qui est libéré durant les dommages cellulaires, tels que les produits de dégradation des macromolécules, produit des cascades protéolytiques, des composants intracellulaires des cellules nécrosées et des produits de gènes qui sont activés par l’inflammation [231, 237]. Les signaux des cellules endogènes endommagées peuvent activer les TLR2 et TLR4 tels que les heat shock protein (HSP) [131] et le contenu de cellules nécrosées, ce qui a été décrit lors d’ischémie rénale [238, 239].
De cette manière, les TLRs peuvent être perçus comme des récepteurs de surveillance de l’immunité innée et adaptative pour détecter les dommages tissulaires, les infections et le remodelage vasculaire [236].
e.Voie de signalisation dépendante du Myeloïd
differenciation factor 88 (MyD88)
De manière générale, les TLRs sont composés d’un domaine extracellulaire riche en leucines et d’un domaine intra cytoplasmique nommé TIR.
Lors de la fixation d’un ligand spécifique sur ce type de récepteur, le domaine TIR fixe et active la protéine adaptatrice MyD88 qui est aussi composée d’un domaine TIR. Puis, la kinase, IRAK est recrutée et interagit de manière homodimèrique entre les domaines de morts (domaine retrouvé chez beaucoup de protéines responsables de l’apoptose) de IRAK et de MyD88. IRAK s’auto phosphoryle et recrute TRAF6, comme décrit figure 16. Cette dernière
active séquentiellement NIK et IκK qui phosphoryle finalement IκB qui séquestrait NF-κB. IκB phosphorylé est alors détruit par le protéasome alors que NF-κB est dirigé vers le noyau pour jouer son rôle de facteur de transcription sur des gènes spécifiques à l’activation de la CPA qui possède les TLRs et pour le recrutement et l’activation de cellules adaptées à la défense du « soi » mais aussi des gènes impliqués dans la réparation [240].
Différentes études ont démontré que TLR4 et surtout la voie MyD88, étaient responsables d’une augmentation des lésions rénale après IR [241, 242].
Figure 16 : Voies de signalisation TLR dépendantes et indépendantes de MyD88 intervenant
dans la reconnaissance de bactéries [243].