CHAPITRE 2 : DESCRIPTION DES OUTILS UTILISES POUR L’EVALUATION
A. Evaluation qualitative et quantitative de l’ARN total extrait
Après l’extraction de l’ARN, il est conseillé de vérifier la qualité de l’extrait. Il doit posséder un ARN non dégradé et être exempt d’ADN génomique résiduel. Cette méthode nous permettra de déterminer la technique d’extraction la plus optimale.
Il est également important de déterminer la quantité d’ARN total contenu dans l’extrait, de manière à normaliser la quantité de matériel dans toutes nos conditions, avant la PCR.
Pour cela nous avons comparé deux méthodes, l’une classique regroupant la migration sur gel d’agarose et le dosage par spectrophotométrie et l’une plus récente utilisant des micro- puces (Agilent Bioanalyser) permettant le contrôle de qualité et la quantification.
1.Evaluation Qualitative
a.Evaluation par migration sur gel d’agarose
L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode utilisée pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de leur taille. Cette technique est basée sur la séparation des acides nucléiques en fonction de leur charge (négative) et de leur taille sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.
Dans un premier temps il faut réaliser un gel d’agarose (0.8%), et le couler dans un bloc pour migration. Nous déposons dans les puits, un mélange de l’ARN extrait, avec un tampon de charge et du SYBR green, molécule se plaçant entre les acides nucléiques doubles brins.
Enfin les bandes d’ARN ainsi séparées sont visualisées en lumière UV.
Après une extraction de bonne qualité, nous devons retrouver 2 bandes bien distinctes
Les ribosomes sont constitués de deux sous unités : une grande sous unité composée en majorité d’ARN 28S (« s » pour Svedberg unité de mesure du taux de sédimentation) et d’une petite sous unité composée d’ARN 18S. Cette répartition est retrouvée chez tous les eucaryotes.
Figure 29 : (A) Schéma représentant une migration électrophorétique, sur gel d’agarose,
d’ARN de bonne qualité (B) Numérisation d’un gel
Si l’ARN est partiellement dégradé, plusieurs bandes apparaissent de manières moins visibles. Si l’extrait possède de l’ADN génomique contaminant, une 3ème bande migrant sera présente. L’échantillon n’est donc pas exploitable dans ces deux deniers cas.
b.Evaluation par migration en micro-puces
L’Agilent Bioanalyser 2100 commercialisé par Agilent biotechnologies permet d’analyser l’ARN présent dans des échantillons par une technique d’électrophorèse en gel miniaturisé.
Le principe reste le même que pour l’électrophorèse sur gel d’agarose qui consiste en une migration en fonction de la charge et de la taille des acides nucléiques. 12 échantillons peuvent être analysés par une puce RNA nano LabChip® (Figure 30 A) en 30mn, composée
de puits reliés à des micro-filières. L’échantillon dont les molécules d’ARN sont préalablement marquées par fluorescence est injecté dans ce micro-réseau, puis séparé par migration électrophorétique (Figure 30 B). Les molécules sont détectées par leur fluorescence
en fonction de leur charge électrique.
Figure 30 : (A) Puce RNA LabChip®. (B) 1 : l’échantillon se déplace dans les micro-filières
2 : l’échantillon est injecté dans les filières de séparation. 3 : les différents composants sont alors séparés de manière électrophorétique. 4 : les composants sont détectés par leurs fluorescences et les bandes détectées sont intégrées en pics électrophorétiques.
L’Agilent bioanalyser a l’avantage de donner une représentation graphique, qui permet d’analyser avec précision la qualité, la pureté, et la quantité de l’ARN.
L’Agilent permet de détecter plusieurs régions correspondantes à des pics (Figure 31) :
- Le 1er pic : marqueur intégré à tous les échantillons
- Le 2ème : ARN 5S (constituant de la grande sous unité ribosomal) - Le 3ème : ARN 18S
- 4ème pic : ARN 28s
Figure 31 : Représentation des différentes régions obtenues après électrophorèse en gel
miniaturisé d’ARN.
La qualité de l’ARN est évaluée par le RNA Integrity Number (RIN) développé par Agilent, qui donne une note sur 10 de la qualité de l’ARN et qui prend en compte dans son calcul l’intégrale des pics d’ARN 18 et 28S. Comme nous pouvons le voir dans la figure 32,
un échantillon ayant un RIN à 5,8 commence à être partiellement dégradé. Les échantillons dont le RIN est inférieur à 5 doivent alors être exclus.
Un échantillon de RNA Ladder (commercialisé par Agilent) qui contient un mélange d’ARN de taille et quantité connu, permet de quantifier en ng/µL, l’ARN extrait. Puis le logiciel prend en compte la surface des pics de l’ARN 18S et 28S.
Figure 32 : Exemple de 2 échantillons extraits (A) ARN de très bonne qualité (B) ARN
partiellement dégradé.
Après avoir testé les deux techniques de quantification de l’ARN, nous pouvons dire que l’Agilent Bioanalyser est un outil qui se révèle indispensable pour connaître parfaitement la qualité de l’ARN extrait à partir de tissus de rein.
De plus, nous avons choisit d’utiliser cette technique car elle fait actuellement figure de référence dans le contrôle de la qualité de l’ARN extraite à partir de tissus [481, 482].
2.Evaluation Quantitative
Même si la quantité d’ARN peut être fournie par la technique Agilent, elle est également dosée par spectrophotométrie (Victor) par mesure de la Densité Optique (DO) à partir d’un échantillon d’ARN solubilisé dans de l’eau pure. La lecture de l’absorbance se fait à 260 nm et à 280 nm, longueur d’onde à laquelle l’ARN et les protéines absorbent respectivement. Le rapport d’absorbance 260/280 doit être supérieur ou égal à 1,7. S’il est plus faible, cela signifie que la quantité de protéines est trop importante et qu’une purification doit être de nouveau réalisée. Ce rapport est important, car les protéines empêchent le bon déroulement des réactions enzymatiques qui suivent.
Grâce à cette étape, nous avons égalisé les quantités d’ARN de chaque échantillon avant A
La formule de quantification est alors la suivante : Concentration en ARN= (DO260-
DO260 blanc) x 40 x 50*4
DO260 :mesure de l’ARN
DO260 blanc :mesure du bruit de fond créé par l’eau
40 : coefficient de la longueur d’onde de l’ARN 50 : dilution réalisée pour la mesure
4 : coefficient prenant en compte la taille du puit de mesure
De cette manière nous obtenons une concentration d’ARN en µ g / mL. L’échantillon sera alors dilué dans le kit de reverse transcription afin de charger une quantité fixe de 4µ g d’ARN par tube d’essai.