Les effets précoces de l’utilisation du PEG dans les solutions de conservation

Le PEG améliore la reprise de filtration glomérulaire. Dans la première partie de ce travail, notre objectif a été de comparer les effets des différents PEG utilisés en solution de conservation sur la fonction de la filtration glomérulaire et son impact sur la santé de l’animal.

Les clairances de la créatinine, qui représentent la fonction glomérulaire, sont significativement meilleures durant les quinze premiers jours de reperfusion dans les groupes PEG par rapport au groupe UW sauf pour le groupe PEG 35kDa 30g/L dont tous les animaux seront euthanasiés avant le terme de l’étude.

Dans les groupes PEG 35kDa, nous mettons en avant un effet dépendant de la concentration de celui-ci. Plus la concentration de PEG 35kDa est grande et plus ces animaux ne récupèrent pas leur fonction rénale au cours des six premiers jours de la reperfusion, ce qui conduit à leur euthanasie avant terme. Toutefois deux porcs sur trois du groupe PEG 35kDa 15g/L ont une clairance de créatinine normale à onze jours, tout comme les trois porcs du groupes PEG 35kDa 5g/L.

Nous mettons alors en évidence une différence significative entre les tailles de PEG utilisées en montrant une fonction glomérulaire normale, précoce pour les groupes PEG 20kDa (5 à 7 jours) par rapport à ceux des groupes PEG 35kDa.

Nous pouvons déjà mettre en évidence que la solution PEG 20kDa 15g/L est associée à une survie de tous les animaux opérés (5) et à un retour plus rapide à la normalisation de la clairance de créatinine (5 jours).

1.La solution PEG 35kDa induit des lésions tubulaires

rénales au cours de la conservation

Nous avons étudié les lésions histologiques caractéristiques qui ont lieu au cours de l’ischémie froide, pour tenter de trouver une cause aux phénomènes observés très précocement à la reperfusion. Pour cela nous avons comparé la progression des lésions tubulaires au cours de la conservation sur chaque tissu.

D’une manière générale, les lésions sont plus fortes dans les tissus PEG 35kDa que dans les autres tissus dès 6 heures de conservation.

De plus, plus la concentration de PEG 35kDa augmente et plus la perte de la bordure en brosse semble forte au cours de la conservation. Ceci est parfaitement corrélé avec les données précédentes : plus les lésions tubulaires sont intenses et plus la reprise de fonction glomérulaire est tardive et plus la survie animale à long terme est compromise.

Nous avons mis en avant une meilleure protection des lésions de la desquamation endoluminale avec le PEG 20kDa 15g/L à partir de 24 heures de conservation par rapport aux autres conditions expérimentales.

2.Analyse des mécanismes de défense cellulaire au cours

de l’ischémie froide

Nous avons comparé, dans un deuxième temps, la mise en place des mécanismes de résistance aux lésions de l’hypoxie et de l’hypothermie au cours de l’ischémie froide, à travers une exploration de l’expression transcriptomique de certaines familles de gènes.

Nous avons, tout d’abord, cherché à observer le gène HIF-1α, dont la protéine stabilisée lors de l’hypoxie initie la synthèse de gènes du remodelage vasculaire dont VEGF. L’activation du remodelage vasculaire est initiée par le récepteur de VEGF, Flk-1, dont l’expression est aussi analysée. Nous notons tout d’abord que l’expression de ces gènes dans le tissu du groupe UW est proche de celle du tissu témoin (tissu sain sans ischémie ni reperfusion).

Ensuite, l’expression du gène HIF-1α est marquée après 24 heures de conservation. Elle est de plus en plus intense dans le groupe PEG 20kDa 15g/L, PEG 35kDa 5g/L et PEG 35kDa 15g/L respectivement.

Toutefois nous ne retrouvons pas ses effets sur le gène de VEGF et Flk-1. Ceci démontre un point essentiel de nos travaux : l’analyse de l’expression d’un gène ne reflète pas sa fonction protéique. Il faudra une exploration protéomique des tissus conservés, tel que l’immunomarquage ou la technique du western blot, pour confirmer les variations de l’expression transcriptomique observée.

Ainsi, même si le gène associé à l’hypoxie semble transcrit au cours de l’ischémie, la traduction se fait peut être difficilement à cause du ralentissement du métabolisme à froid. La protéine HIF n’est donc pas en quantité suffisante pour transloquer au noyau et activer les différents gènes liés à l’hypoxie dont VEGF et Flk-1.

Nous notons toutefois que les gènes de VEGF et Flk-1 sont fortement sous-exprimés et encore plus dans les groupes PEG 35kDa. Nous supposons alors que le tissu n’a pas besoin du remodelage vasculaire pour le moment et que le but principal est de combattre le stress cellulaire. Au cours de l’ischémie froide, le tissu aurait besoin de produire uniquement les gènes indispensables à la survie cellulaire.

C’est pourquoi, nous nous sommes aussi intéressés à la variation transcriptomique des principaux marqueurs du stress cellulaire, les Heat shock proteins (HSPs), dont le rôle principal est une fonction de chaperonne et ainsi d’aider la cellule à survivre ou la mener vers une mort programmée (moins anarchique que la nécrose).

Ainsi, certains auteurs envisagent que les HSPs soient impliquées dans les mécanismes de protection mais aussi dans les mécanismes de réparation [100].

Selon la solution de conservation étudiée, nous avons mis en évidence une collaboration différente de gènes entre eux. Le gène de HSP70 est exprimé dans tous les tissus quelque soit la condition expérimentale, même s’il semble un peu moins présent dans les tissus des groupes PEG 20kDa en général. En corrélation avec nos données précédentes, nous déduisons qu’HSP70 est un marqueur lésionnel dont le rôle de chaperon peut conduire à la survie cellulaire ou les détourner de la nécrose vers l’apoptose [118].

Dans les tissus du groupe PEG 20kDa 15g/L, nous avons une sur-expression de tous les gènes du stress. Les HSP27 fixent les protéines dénaturées et ont besoin d’HSP70 pour les replier convenablement. De même HSP90 a besoin d’HSP70 pour appliquer sa fonction de chaperonne [84]. De plus, les HSP90 participent à la protection du stress oxydant et réduisent les dommages de l’IR rénale [102] ce qui pourrait expliquer la forte expression de ce gène dans les tissus de ce groupe. En association avec les déductions précédentes nous en déduisons un effet bénéfique à la survie cellulaire et surtout une mise en place organisée.

Les tissus des groupes PEG 35kDa semblent les exprimer massivement de la même manière que les tissus PEG 20kDa 15g/L. Cependant nous notons une expression précoce qui s’épuise à 24 heures pour les concentrations de 15 et 30g/L de PEG 35kDa.

Nous remarquons que le tissu PEG 20kDa 20g/L ne semble pas sur-exprimer les gènes HSP27 et HSP70, tandis qu’il sous-exprime fortement HSP90.

Le tissu ne semble pas mettre en place de mécanismes de défense adaptés contre les lésions de l’ischémie froide à travers les gènes que nous avons étudiés. Il serait intéressant de compléter cette évaluation avec d’autres marqueurs transcriptomiques comme ceux du stress oxydant.

Durant cette étude génomique des mécanismes de protection et de défense contre le stress de l’ischémie froide, nous avons à nouveau mis en avant le PEG 20kDa 15g/L pour ses effets positifs permettant une adaptation coordonnée des tissus. De plus, il semble que le tissu PEG 35kDa 30g/L exprime moins ces gènes testés. En corrélation avec les précédentes données, nous pouvons en déduire des lésions très intenses qui auraient dépassées les mécanismes de défense dès 24 heures de conservation.

3.Le potentiel d’agrégation érythrocytaire du PEG

pourrait être impliqué

Comme nous l’avons décrit dans la précédente étude, le but de l’utilisation du PEG était de remplacer le HES dans la solution de conservation [8, 14, 389-392]. Il a été démontré que ce dernier augmentait la viscosité de la solution UW [503] et augmentait aussi les amas de globules rouges pouvant perturber le lavage et induire une reperfusion inhomogène [387, 388, 504]. Mosbah et coll. ont alors démontré que le PEG, quelque soit sa taille, avaient une viscosité moindre par rapport à HES et inhibaient l’agrégation érythrocytaire [504]. Cette explication est en corrélation avec nos données du PEG 20kDa face au HES contenu dans UW, mais pas avec celles du PEG 35kDa.

Le PEG 35kDa est plus délétère que l’UW et le PEG 20kDa, et sa concentration croissante augmente ses effets. Cependant l’étude de Mosbah et coll., compare les effets du PEG 35kDa 1.05g/L à HES. Une grande concentration de cette taille de PEG (dès 5g/L selon notre étude) peut être à l’origine d’une plus grande agrégation des globules rouges que HES.

Une ancienne théorie, évoquée par Chien, permet d’expliquer la relation entre la taille et la concentration d’un colloïde tel que le PEG, et l’agrégation des érythrocytes. Cette théorie est basée sur la surface d’adsorption que présente le colloïde pour former un pont avec les érythrocytes les plus proches [505].

Plus la concentration de PEG est forte et plus la « surface » est grande, de même pour la taille. Même si, HES (250kDa) est beaucoup plus grand que PEG 35kDa, sa structure moléculaire est sphérique [506] et présente moins de site de liaison que le PEG qui est linéaire, d’où un effet moindre de PEG 35kDa 1.05g/L par rapport à HES 50g/L.

Ainsi, plus le PEG est grand ET concentré et plus il adsorbe les globules rouges,

réduisant ainsi l’efficacité du lavage et bouchant les capillaires péritubulaires, ce qui aura des conséquences au moment du lavage, de la reperfusion du rein et sur la reprise de la fonction glomérulaire.

Le PEG 35kDa 30g/L étant la taille et la dose la plus forte, nous supposons une agrégation massive et un rinçage minime du rein.

Il est à noter que le PEG met environ une semaine à être éliminer après reperfusion. Nous pouvons alors supposer une perturbation de la reperfusion précoce : agrégation des érythrocytes et du PEG 35kDa (15 et 30g/L) adsorbés en surface des capillaires péritubulaires du rein. Cette agrégation pourrait être à l’origine de nouvelles lésions associées à la reperfusion.

B.Les effets à long terme de l’utilisation du PEG dans les solutions