L’infection par les lentivirus permet une expression importante, stable et étendue du transgène dans

a. Absence de toxicité du lentivirus

Pour évaluer si l’injection d’un lentivirus dans le parenchyme cérébral induit une réponse inflammatoire ou affecte la survie neuronale, des rats appartenant aux groupes lenti-CNTF, lenti-LacZ et Veh ont été injectés avec trois concentrations de virus (100, 200 et 300 ng p24/ µL) et leur cerveaux ont été étudiés à deux semaines ou deux mois post-infection (n=4-5/ groupe). Les rats infectés ne présentent pas d’anomalies visibles (apparence, comportement) et ont une croissance pondérale normale.

Les macrophages et la microglie active sont détectés par des anticorps dirigés contre la protéine Cd-11b (Fig. 1A) ou ED1 (Fig. 1B); ils ne sont visibles qu’au niveau du site d’injection, quel que soit le groupe considéré. De plus, un marquage ubiquitaire des cellules avec la gallocyanine démontre qu’il n’y a ni perte cellulaire massive ni prolifération microgliale à proximité du site d’injection (Fig. 1C).

L’injection de lentivirus ne produit pas, per se, de toxicité majeure, de réponse inflammatoire ou de mort neuronale.

b. Localisation des cellules infectées et diffusion de la protéine transgénique

Des expériences ont démontré que le lentivirus utilisé dans cette étude infecte les neurones à 99% (de Almeida et al., 2001). Le transport du lentivirus et sa diffusion dans d’autres structures cérébrales sont moins bien caractérisés. Pour mettre en évidence les neurones infectés par le lentivirus dans différentes structures cérébrales connectées avec le striatum (pallidum, cortex moteur et substance noire), on utilise la technique de RT-PCR en temps réel qui permet de détecter une séquence spécifique des ARNm d’origine virale et de comparer son abondance relative entre ces structures. Les ARNm présents dans ces structures chez des rats du groupe lenti-CNTF/Veh (n=3) ont été extraits, ‘reverse transcrits’ et amplifiés. La quantification relative de l’abondance de la séquence transgénique dans l’hémisphère injecté avec lenti-CNTF montre que l’ARNm d’origine virale n’est détectable que dans le striatum (Fig. 2). Les structures efférentes au striatum (i.e. pallidum et substance noire réticulée) et les structures afférentes au striatum (i.e. cortex moteur et substance noire compacte) ne produisent pas d’ARNm viral. Ceci démontre que le lentivirus n’a pas été transporté de façon rétrograde, le long des axones vers les neurones projetant sur le striatum, ni de façon antérograde vers les structures de projection. Les cellules striatales sont les seules cellules qui ont été infectées, qui ont intégré le génome viral et qui synthétisent de façon stable l’ARNm transgénique.

Un marquage immunohistochimique de la β-galactosidase permet de mettre en évidence l’expression de la protéine transgénique par les cellules infectées. La majeure partie des cellules infectées se trouve dans le striatum, à proximité du site d’injection (Fig 3A). Des cellules exprimant la β-galactosidase sont aussi visibles dans le cortex et dans le striatum le long du corps calleux qui constitue une barrière de diffusion pour les virus. La β-galactosidase, qui est couplée à un signal de localisation nucléaire est principalement exprimée dans le noyau. Du fait du fort niveau d’expression, un marquage neuritique est aussi visible dans le striatum (Fig 3B) et dans les structures de projection du striatum comme le globus pallidus (Fig 3C) et la substance noire réticulée (Fig. 3D). Dans ces structures, seuls les axones des neurones striataux sont marqués et aucun noyau n’est visible (Fig 3E). Ceci confirme l’absence d’infection virale directe des cellules appartenant à ces structures.

Ainsi, l’infection lentivirale dans le striatum conduit à une surexpression locale du transgène, associée à une production dans les structures de projection du striatum après transport de la protéine transgénique le long de l’axone.

c. Stabilité de l’expression du transgène dans le temps

La protéine transgénique (β-galactosidase) est détectée par immunoblot dans le striatum des rats infectés avec le lenti-LacZ (titre : 100 ng p24/µL) à des temps post-infection variant de 15 jours à 5 mois (n=3-4/groupe). On détecte la présence de la β-galactosidase dans tous les cas avec un niveau d’expression variable selon les individus. Aucune diminution du niveau d’expression n’est visible jusqu’à 5 mois (Fig. 4A).

Le volume d’infection (i.e. volume β-galactosidase immunopositif) est quantifié de manière à évaluer la stabilité de l’expression du transgène (entre 15 jours et 2-5 mois) et l’effet du titre viral sur l’étendue des cellules infectées. Le volume présentant un marquage représente environ 3 à 10% du volume total du striatum (Fig. 4B, C). Le volume contenant des cellules infectées dépend du titre viral (p<0,0001 pour ‘l’effet titre viral’, MANOVA) mais il reste stable au cours du temps (p=0,26 pour ‘l’effet temps post-infection’, MANOVA). Le volume d’infection est significativement plus réduit avec un titre infectieux de 100 ng p24/µL (p<0,05, test de Scheffé) par rapport aux titres 200 et 300 ng p24/µL (Fig. 4C).

Ces résultats montrent que l’infection lentivirale permet une surexpression stable du transgène dans le striatum.

d. Optimisation du modèle d’activation astrocytaire par le CNTF

Pour étudier les conséquences de l’activation astrocytaire sur le fonctionnement cérébral, il est important que la surexpression du CNTF induise une activation importante, étendue dans le striatum et stable sur plusieurs mois. Des marquages immunohistochimiques de la vimentine, un filament intermédiaire absent dans le striatum adulte et qui est induit par le CNTF (Levison et al., 1996) ont été réalisés 15 jours post-infection sur des rats injectés avec des doses croissantes de virus (0,1; 1; 5; 10; 100; 200; 300 ng p24/µL). Le volume présentant un marquage pour la vimentine augmente avec le titre viral utilisé avec un plateau à partir de 100 ng p24/µL (Fig. 5A, B). Ce volume, qui correspond à la zone de diffusion du CNTF, est largement plus important que la zone des cellules infectées estimée avec la β-galactosidase (cf. § précédent). Par exemple, pour un titre de 100 ng p24/µL, le volume d’infection est de 0.9 mm3 alors que le volume d’activation des astrocytes est de 18 mm3, soit les deux tiers du striatum. Ceci est lié au fait que le CNTF est sécrété (le gène du CNTF est fusionné à la séquence signal des immunoglobulines, voir §III-A) et il peut donc diffuser à partir des cellules productrices infectées. Pour les titres les plus élevés, un marquage est également observé dans le cortex, le long du corps calleux du fait de la diffusion limitée des virus au cours de l’injection (Fig. 5B). Pour étudier la stabilité de l’effet du CNTF sur les astrocytes, les mêmes marquages ont été réalisés à 2 mois post-infection pour les trois titres les plus élevés. Les volumes d’activation ne sont pas différents entre les trois groupes, comme observé en 5A (p=0,54, pour l’effet ‘titre infectieux’, MANOVA), et sont similaires à ceux mesurés à 15j post-infection (p=0,74 pour l’effet ‘temps post-injection’, MANOVA, Fig. 5C). En revanche, l’intensité du marquage est significativement plus faible pour les titres les plus élevés (*p<0,05 vs 100 ng p24/µL, Mann-Whitney, Fig. 5D). En réalité, cette atténuation des effets du CNTF sur l’expression de la vimentine est déjà visible à 15 jours post-infection pour le titre de 300 ng p24/µL (Fig. 5D). L’atténuation des effets visibles du CNTF peut être due à une baisse régulée de l’expression du transgène dans les cellules infectées ou à une diminution des effets du CNTF sur les cellules cibles par un phénomène de ‘down-regulation’ de la voie de signalisation qui est assez bien caractérisé pour les cytokines (Krebs et Hilton, 2000).

L’ensemble de cette caractérisation montre que le titre optimal est de 100 ng p24/µL puisqu’il induit une activation astrocytaire dans une grande partie du striatum qui est maintenue au cours du temps. Les expériences suivantes ont donc été réalisées entre 15 jours et 6 mois après une injection intra-striatale de véhicule (Veh), ou des virus lenti-CNTF ou lenti-LacZ à 100 ng p24/µL.