Identification phénotique ou biochimique des bactéries lactiques

L’isolement, la purification et l’identification ont concernés 40 souches (Gram (+), immobiles, catalase (-)) des deux fabrications après énumération dans les milieux M17 et MRS, et ceci aux différents stades de fabrication sur un total de 128 souches isolées. Ces souches se répartissent comme suit 20 coques de S1 à S20 et 20 bacilles de L1 à L20. Les tableaux donnés en Annexe IV illustrent les caractères de chaque souche isolée et identifiée pour les coques et pour es bacilles, respectivement.

Les résultats du classement des espèces que nous avons isolées sont basés sur les travaux des références GUIRAUD (1998). Les bactéries se rapprochant aux différents genres et espèces des coques et des bacilles lactiques rencontrés dans le fromage Bouhezza au cours de sa fabrication sont résumés dans les tableaux 11 et 12.

II.1.3.1. Coques lactiques

Les coques lactiques rencontrées dans le fromage Bouhezza au cours de la fabrication sont rassemblé dans le tableau 11. Les coques lactiques sont représentés par cinq genres soit Leuconostoc (30%), Lactococcus (20%), Pediococcus (20%),

Streptococcus (15%) et Enterococcus (15%).

Tableau 11. Bactéries se rapprochant des différents genres et espèces des coques rencontrées dans le fromage Bouhezza

Groupes Genre Bactéries se rapprochant aux espèces

Souches concernées

Coques

Leuconostoc (30%) L. mesenteroide subsp mesenteroides

6 souches (S2,S3, S5, S8, S10

et S14)

Lactococcus (20%) L. lactiscremoris 4 souches (S9, S12, S15,S17,S19)

Pediococcus (20%) P. acidilactici P. pentosaceus

2 souches (S1 et S13) 2 souches (S7 et S18)

Streptococcus (15%) S. thermophilus 3 souches (S2, S16 et S20)

Enterococcus (15%) E. durans 3 souches (S4, S6 et S11)

Dans le genre Leuconostoc six souches ont été déterminées soit S2, S₃, S₅, S₈, S₁₀ et S₁₄. Toutes ces souches présentent un développement positif à 10°C, à pH 9,6 et une teneur en NaCl de 4 et 6,5%. Elles sont sensibles à la température et ne dégradent pas la dextrine. Seule la souche S10 est fructose et citrate négatifs. Ces souches ont été appariées aux espèces de L. mesenteroide subsp mesenteroides. Elles interviennent dans la production d’acides, participent à la protéolyse et à la lipolyse, et à la production de CO2 et de composés aromatiques. Elles sont capables de produire l’acetoine à partir du citrate et interviennent directement dans l’arôme (Mc SWEENEY, 2004 ; LORE et al., 2005). Selon GARABAL (2007), L. mesenteroide subsp mesenteroides fait partie de l’écosystème microbien du fromage Greek Anevato. D’autre part, selon CASEY et al., (2006), les

bactéries lactiques indigènes (NSLAB) identifiées dans les fromages sont constituées de quatre groupes : lacobacilli mésophiles, pediococci, enterococci et Leuconostoc. La présence de quelques espèces du genre Leuconostoc a été signalée dans le fromage Ragusana (RANDAZZO et al., 2002), dans le fromage Epoisses (OGIER et al., 2004) et dans le Lben traditionnel tunisien (SAMET-BALI et al., 2012).

Les cinq souches rencontrées dans le genre Lactococcus (S9, S12, S15 ,S17 et S19) ne résistent pas à la température de 60°C/30 min et ne se développent pas en présence de saccharose, de fructose et de dextrine et ne possèdent pas B galactosidase. Seules les souches S 12 et S19 sont mannitol positif. Ces quatre souches ont été rapprochées par leurs caractères à l’espèce L. lactis cremoris.

Deux souches rencontrées dans le genre Pediococcus (S₁ et S₁₃) ont un développement positif à 45°C, en présence de saccharose et de fructose, ce pendant elles sont lactose négatif. Pour ces raisons elles ont été rapprochées à l’espèce P. acidilactici. Les deux autres souches (S₇ et S₁₈) ont par ailleurs les caractères précités opposés, et elles ont été affilées à l’espèce P. pentosaceus. Les pediocoques représentent la flore normale des Cheddars affiné. Selon LEJAOUEN (1997) P. pentosaceus pourrait oxyder le lactose, peptides et L- et le D-lactate. Equipement varié en aminopeptidases, dipeptidases et protéases intracellulaires

Le genre des Streptococcus (15 %) est représenté par trois souches (S2, S16 et S20). Elles ne se développent pas à 10°C (sauf S₁₆), à pH 9,6, à une teneur en sel de 6,5 % et en présence de mannitol, de fructose, de dextrose et de citrate. Nous avons situé ses souches à l’espèce S. thermophilus. Selon RANDAZZO et al. (2006) S. thermophilus est la souche dominante, dans le fromage Pecorino, après L. lactis.

Le reste des souches du groupe des coques lactiques, soit S4, S6 et S11 ont été associées par leurs caractères au genre des Enterococcus (15%). Ces souches se développent positivement à 10°C et à 45°C, résistent à la pasteurisation, et aux milieux hyper-salé ou basique. D’autre part, elles ne dégradent pas le mannitol, le fructose, la dextrine et le citrate. Ces souches ont été situées avec l’espèce E. durans.

II.1.3.2. Bacilles lactiques

Les bactéries lactobacilles rencontrées dans le fromage Bouhezza au cours de la fabrication sont rassemblées dans le tableau 12.

Lactobacillus est le genre le plus important au sein du groupe des bactéries

lactiques. Basée sur les séquences d'ARNr 16S, les lactobacilles sont phylogénétiquement répartis en sept groupes : lb buchneri (bu), lb casei (ca), lb delbrueckii (de), lb plantarum (pl), lb reuteri (re), lb sakei (sa) et livres salivarius (sl). Traditionnellement, le genre est divisé en trois groupes selon les voies de fermentation des hydrates de carbone: (1) homofermentaire et hétérofermentaires obligés (2) facultative (3) lactobacilles hétérofermentaires obligés (De ANGELIS et GOBBETTI, 2011).

Concernant le groupe des bacilles lactiques du fromage Bouhezza, nous avons recensé dans un premier groupe 7 souches (L4, L6, L11, L14, L16, L17 et L18) qui ne se développent pas à 45°C, et qui fermentent la plus part des sucre (lactose, mannitol, saccharose, maltose, fructose et glucose). Seules les souches L₁₄ et L₁₈ n’utilise pas la dextrine. Ces souches se rapprochent à l’espèce L. casei/Pseudo-plantarum (35 %). Ceci, confirme nos résultats de l’identification par la PCR-TTGE, où la bande Φ, correspondante Lb. paracasei/Lb. casei/Lb. rhamnosus a été identifiée. Selon GARABAL (2007), les souches suivantes font partie de la flore lactiques indigène des fromages :

Leuconostoc spp., Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. brevis, Lb. plantarum, Lb. paracasei, Lb. salivarius, et Lb. rhamnosus.

Tableau 12. Bactéries se rapprochant du genre Lactobacillus dans le fromage Bouhezza

Groupes Genre Bactéries se rapprochant aux espèces Souches concernées Bacilles Lactobacillus Lactobacillus casei/Pseudo-plantarum (35%) 7 souches (L4, L6, L11, L14 , L16, L17 et L18) Lactobacillus acidophilus groupe Thermobacterium (25%) 5 souches (L1, L5, L9, L10 et L15)

Lactobacillus brevis groupe betabacterium (20%)

4 souches (L2, L7, L13, L20)

Lactobacillus sake (20%) 4 souches (L3, L8, L12, L19)

Le deuxième groupe rassemble 5 souches (L₁, L₅, L₉, L₁₀ et L₁₅) thermophiles et qui ne se développe pas à 10 °C (sauf L5 et L15) et à 15°C. Ces souches n’utilisent pas le mannitol et la dextrine, elles ont été rapprochées à l’espèce L. acidophilus groupe

Le troisième groupe de ces bactéries concerne 4 autres souches (L2, L7, L13, L20) qui se développent à 10 °C (sauf L20) et à 15°C mais pas à 45°C. Ces souches fermentent le saccharose, le fructose et le glucose et sont le seul groupe hétéro-fermentaire. Nous les avons rapprochés à l’espèce de L. brevis groupe Betabacterium (20%).

Les souches du quatrième groupe (L3, L8, L12, L19) présentent des caractères semblables aux souches du troisième groupe mais utilisent en plus le maltose et sont homo-fermentaires. Ces souches sont comparables par leurs caractéristiques biochimiques à l’espèce Lb. sake (20%).

Conclusion partielle

Durant toute la période de la fabrication-maturation, les comptes des bactéries lactiques indigènes (lactobacilles et lactocoques) et des levures-moisissures sont restés presque stables (soit respectivement de 6 à 7 log ufc/g et de 5 à 6 log ufc/g).

Dans l'écosystème de Bouhezza, il y avait également une diversité bactérienne considérable confirmée par la PCR-TTGE et l’identification phénetique.

Selon la PCR-TTGE, quelques espèces ont été détectées toutes au long de la fabrication-maturation (Lc. Lactis, Lb. Plantarum et Leuconostoc cremoris/Ln.

mesenteroides), d’autres au début de la maturation (S. gallolyticus subsp macedonicus) ou

seulement détectées après additions de lait cru (Lb. delbrueckii subsp. lactis). Les conditions hygiéniques pendant la fabrication et la maturation sont nécessaires pour obtenir un produit de bonne qualité ceci est confirmé par l’absence de bactéries pathogènes

Salmonella, Staphylococcus aureus, Listeria, and E. coli O157H7).

D’après les résultats de l’identification phénetique, le genre Lactobacillus est le genre dominant des bactéries lactiques dans le Bouhezza. Les coques identifiées appartiennent à cinq genres (Leuconostoc, Lactococcus, Pediococus, Streptococcus

Enterococcus). Ces espèces doivent intervenir dans l’affinage de notre fromage vu l’effet