Caractérisation des bactéries lactiques par la PCR-TTGE

Les profils de la PCR-TTGE du fromage de Bouhezza de ferme à différents périodes d’affinage sont comparés dans la figure 27. Nous rappelons que l’identification des différentes bactéries est basée sur des données d’espèces de références selon PARAYRE et al. (2007).

A B

Figure 27: Profil de la PCR-TTGE du fromage Bouhezza de ferme

(A) Echantillons de Bouhezza de quatre ferme différentes, affinés à 60j ;(B) Echantillons de Bouhezza de six fermes différentes, affinés respectivement à 45j, 60j, 75j et 120j (SAOUDI, 2012), M, Marqueurs d'ADN génomique de la base de données d’espèces bactériennes de référence (colone M) (Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecium, Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Corynebacterium moorparkense, Lactobacillus paracasei, Arthrobacterium nicotianae, and Brevibacterium casei).

L’assignation des bandes de la PCR-TTGE des échantillons du Bouhezza par rapport aux espèces de bases de références selon PARAYRE et al. (2007) est la suivante : a, Lb. plantarum/Lb. johnsonni ou Lb. gasseri; d, Staphylococcus equorumsubsp. Linens ; j, Lb. helveticus/Lb. acidophilus ou Lb. Crispatus; p, Lc. Lactis subsp. cremoris ; x, C. flavescens; Φ, Lb. paracasei/Lb. casei/Lb. rhamnosus/Lb. zeae ou B. infantis ;

?, bande inconue.

Les fromages de fermes présentent une bonne diversification en bactéries lactiques. Les profils donnés montrent la présence régulière dans tous les fromages de deux espèces

Lb. plantarum et Lactococcus lactis subsp. cremoris (Fig. 27 A et B). Les travaux réalisés

en collaboration avec SAOUDI (2012) (Fig. 27 B) sur des fromages de ferme montrent la présence de principalement Lactobacillus plantarum et Lactococcus lactis subsp. cremoris poursuivie par Lactococcus helveticus et/ou Lactococcus acidophilus /Lactococcus

crispatus. Une autre souche rencontrée dans 04 échantillons est Staphylococcus eqorum subsp. linens. Aussi, les résultats dévoilent que le Bouhezza de 120 j d’affinage avait une

charge microbienne faible mais variée avec détection de plus de 10 bandes dans son profil de la PCR-TTGE (Fig. 27). La présence d’une bande non identifiée est apparue dans l’ensemble des fromages de ferme.

D’autre part, et dans le cadre du projet Intégré du Développement de la Filière laitière et Fromagère en Algérie (Italie-Algérie), entre 2009 et 2010, où nous avons été en collaboration avec le CoRFiLaC, une autre analyse d’identification a été réalisée. Les colonies de la flore lactique dénombrées sur MRS et M17 de nos échantillons de la figure 27A ont fait l’objet d’identification par la méthode moléculaire rep-PCR (Repetitive sequence base PCR) et séquençage des genes 16Sr RNA et PCR spécifique à l’espèce. D’après DEGA et al. (2011), cette recherche a confirmé que la microflore de Bouhezza est composée essentiellement de lactobacilles. Les lactobacilles identifiés sont en majorité hétérofermentaires obligée, et appartiennent tous au groupe buchneri. Les espèces des lactobacilles ont été très diversifiées, huit ont été identifiées qui sont Lb. paracasei et Lb.

kefiri, Lb. otakiensis, Lb. plantarium, Lb. fermentum, Lb. parabuchneri, Lb. diolivorans et Lb. hilgardii. Il est important de souligner que Lb. otakiensis a été reconnue seulement en

2009 comme nouvelle espèce du groupe buchneri (WATANABI et al., 2009).

Les profils de la PCR-TTGE du fromage de Bouhezza d’expérimentations à différentes période de fabrication-affinage jusqu’à 70j sont comparés dans la figure 28.

C1 C2

Figure 28: Évolution du profil de la PCR-TTGE de deux fabrications simultanées du fromage Bouhezza (C1 et C2) entre 7j et 70j

M, Marqueurs d'ADN génomique de la base de données d’espèces bactériennes de référence (colonne M) (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecium, Lactobacillus helveticus,

Lactococcuslactis, Streptococcus thermophilus, Corynebacterium moorparkense, Lactobacillus paracasei, Arthrobacterium nicotianae, and Brevibacterium casei).

L’assignation des bandes de la PCR-TTGE des échantillons du Bouhezza par rapport aux espèces de bases de références selon PARAYRE et al. (2007) est la suivante : a, Lb. plantarum/Lb. johnsonni ou Lb. gasseri ; c, Leuconostoc cremoris ou Ln.

mesenteroides; d, Staphylococcus equorum subsp. linens ; h, S. xylosus; i, Lb. brevis ou S. Xylosus ; j, Lb. helveticus/Lb. acidophilus ou Lb. Crispatus ; l, Lb. delbrueckii subsp. Lactis ; m, E. faecalis ou S. succinus ; n, S. gallolyticus subsp. Macedonicus ; p, Lc. Lactis

subsp. cremoris; r,Lb. buchneri; s, B. cereus/B. licheniformis; w, C. variabil; x, C.

flavescens ; Φ, Lb. paracasei/Lb. casei/Lb. rhamnosus/Lb. zeae ou B. infantis ; ? , bande inconue.

L'évolution des profils de la PCR-TGGE dans les deux fabrications de Bouhezza étudiées, C1et C2, était semblable. Dans les profils plusieurs bandes sont apparues indiquant la présence d'un écosystème bactérien riche et diversifié. Quinze bandes ont été assignées à différentes espèces selon les bases de données des références. Plus précisément, la période s’étalant entre la première et la troisième semaine a été caractérisée par la présence de quatre bandes dominantes et vraisemblablement identifié selon la base de données à :

- Lc. lactis‘p’,

- Lb. plantarum ‘a’ (ou Lb. johnsonni / Lb. gasseri) - Leuconostoc cremoris/Ln. mesenteroides ‘c’, - et une bande non identifiées‘ ?’.

Lc. Lactis et Lb. plantarum sont les principales espèces identifiées dans le fromage Bouhezza par la PCR-TTGE. L’identification de Lc. Lactis a été aussi confirmée par la

PCR spécifique sur le gel d’agarose à 1,5% (primer specific PCR). Elle est également l'une des espèces les plus communes trouvées dans les écosystèmes de plusieurs fromages (OGIER et al., 2004). Lc Lactis a été identifiée dans plusieurs types de fromages (RANDAZZO et al., 2002 ; FORTINA et al., 2003; ABRIOUEL et al., 2008) et elle dispose d’un pouvoir protéolytique important sur la caséine β (KUNJI et al., 1995).

La présence d’autres espèces semble être liée à l'âge du fromage. A titre d’exemple, une bande assignée à S. gallolyticus subsp macedonicus n’a été observée qu’entre 7 et 42j. La bande correspondante à S. xylosus‘h’ et la bande correspondante à Lb. Brevis/S.

bande attribuée à Lb. Helveticus n’apparait qu’à partir de trois semaines de fabrication. Lb.

helveticus possède un système protéolytique puissant lui permettant la production de

peptides courts et la libération d’acides aminés après lyse des caséines. Elle joue un rôle important dans l’affinage des fromages (SAVIJOKI et al., 2006).

Une évolution remarquable dans le profil des bactéries lactiques apparait après ajout du lait cru dans le fromage. Les profils changent sensiblement entre 42 et 70j marquées par l’apparition de nouvelles bandes et la diminution de l’intensité d’autres. L'intensité de la bande correspondante à L. plantarum aussi bien que celle de l’espèce inconnue ‘ ?’ ont diminué et Lb. delbrueckii subsp. lactis ‘l’ a apparu à partir de 42j (Fig. 28).

Une présence intermittente durant les dix semaines de fabrication-maturation a été aussi signalée pour d’autres espèces. C’est de cas des bandes assignées à :

- Lb. paracasei/Lb. casei/Lb. rhamnosus ‘Φ’, - Bacillus cereus, Corynebacteriumvariabile‘w’, - Corynebacteriumflavescens‘x’,

- B. Cereus‘s’,

- Lb. buchneri and Bifidobacterium longum ‘r’.

Les espèces de bactéries corynéformes prévalus après 42 jours. La présence et l'évolution de ces espèces doivent être confirmées par des approches spécifiques (PCR spécifique).

Dans certains cas, la PCR-TTGE ne peut pas confirmer les différences entre les micro-organismes qui ont des positions semblables « co-migration » des bandes. Par exemple, les bandes correspondantes à S. xylosus et à Lb.brevis sont trop étroit pour être distingués par des comparaisons avec la base de données.