Greffage de rhodamine B silanis´ee (RBITC-APTES) par co-condensation 156

co-condensation

Le greffage de la rhodamine isothiocyanate (RBITC) sur les nanoparticules a ´et´e r´ealis´e en deux ´etapes. La premi`ere ´etape consiste `a modifier la rhodamine B afin d’y incorporer un groupement tri´ethoxysilane qui va pouvoir dans la deuxi`eme ´etape s’hydrolyser puis se co-condenser avec le TEOS.

3.4.1.1 R´eactifs utilis´es

Les synth`eses d´ecrites ci-dessous ont n´ecessit´e en plus des produits chimiques d´ej`a

pr´esen-t´es pr´ec´edemment : de la rhodamine B isothiocyanate (RBITC, MW = 536g.mol-1,

SIGMA-ALDRICH, CAS 81-88-9, 97%), du t´etrahydrofurane C₄H₈O (THF, MW = 72,11 g.mol-1,

FISHER CHEMICALS, CAS 109-99-9, 99%) et du sulfoxyde de dim´ethyle C₂H₆OS (DMSO,

MW = 78,13 g.mol-1, FISHER CHEMICALS, CAS 67-68-5, 99%).

3.4.1.2 Synth`ese de RBITC-APTES

La premi`ere ´etape consiste `a faire r´eagir la RBITC avec l’APTES et ainsi former une liaison de type thiocarbamide (NH-CS-NH) [478–480]. Dans une proc´edure typique [478–480],

l’APTES (0,373 mol) est m´elang´e `a la RBITC (0,365 mol) dans du THF anhydre3 et sous

atmosph`ere inerte (N2) afin d’´eviter l’hydrolyse de l’APTES mais aussi parce que le groupement

isothiocyanate (NCS)- de la RBITC est sensible `a l’eau. Apr`es 24 heures sous agitation, `a

temp´erature ambiante et dans l’obscurit´e, le THF est ´elimin´e `a l’´evaporateur rotatif et environ 140 mg de RBITC-APTES (M = 757,5 g/mol) sont r´ecup´er´es. La rhodamine ainsi modifi´ee est ensuite mise en solution dans le DMSO `a une concentration de 10 mg/mL dans des r´ecipients opaques pour ´eviter l’alt´eration du fluorophore par photoblanchiment et est stock´ee `a -18◦C. Le sch´ema r´eactionnel de ce couplage est donn´e sur la Figure 3.34.

O OH N N S N H Si O ^O O HN O Cl Si O O ^O NH₂ O OH N N S HN O Cl 20°C, 24 h THF, obscurité

APTES RBITC RBITC-APTES

FIGURE 3.34 : Sch´ema r´eactionnel du couplage de l’APTES sur la rhodamine B isothiocyanate donnant de la RBITC-APTES

3.4.1.3 Conditions de greffage de la RBITC-APTES sur les MSNs

La synth`ese des nanoparticules est effectu´ee en utilisant les mˆemes conditions exp´erimentales que celles d´ej`a d´ecrites dans la section 3.1.1.2 et en utilisant comme silane secondaire la RBITC-APTES. La seule exception est que la solution de RBITC-APTES (10 mg/mL, DMSO, 682 µL) est ajout´ee goutte `a goutte apr`es 10 secondes par rapport `a la fin de l’ajout du TEOS [278]. Cette ´etape est cruciale car nous avons observ´e que des particules en forme de bˆatonnets se formaient si les pr´ecurseurs siliciques ´etaient ajout´es en une seule fois. La quantit´e de RBITC-APTES ajout´ee correspond `a un pourcentage de 0,1% molaire par rapport `a la quantit´e de silane total. Le syst`eme r´eactionnel est aussi prot´eg´e de la lumi`ere pendant toute la dur´ee de la synth`ese afin d’´eviter le ph´enom`ene de photoblanchiment. Les proc´edures de lavages et d’extraction sont les mˆemes que celles d´ej`a d´ecrites pr´ec´edemment (voir paragraphe 3.1.1.2).

Les particules ainsi synth´etis´ees sont nomm´ees MSNs-Rh.

3.4.1.4 Caract´erisations des MSNs fonctionnalis´ees par la RBITC-APTES

Apr`es synth`ese, la suspension collo¨ıdale obtenue est stable. Le diam`etre hydrodynamique des MSNs est de 160 nm avec un indice de polydispersit´e de 0,08. Les clich´es MET r´ev`elent des particules tr`es bien dispers´ees apr`es synth`ese (r´esultats non montr´es) et le comptage r´ealis´e sur environ 100 particules donne une taille de 150 nm avec un coefficient de variation de 0,25. Dans ces conditions de synth`ese, la pr´esence de la rhodamine n’affecte donc pas les propri´et´es morphologiques des particules apr`es synth`ese.

3.4. Etude de l’internalisation des MSNs dans des cellules en culture

FIGURE 3.35 :Sch´ema r´ecapitulatif du greffage de la rhodamine RBITC-APTES par co-condensation avec le TEOS. Dans l’´ethanol, les longueurs d’onde d’excitation et d’´emission de la RBITC-APTES sont ´egales `a 542 nm et 575 nm, respectivement.

Apr`es extraction, les nanoparticules ont ´et´e caract´eris´ees par UV-visible. Sur la Figure 3.36(a), le spectre de la RBITC-APTES montre un maximum d’absorbance `a 549 nm. Ce maximum est retrouv´e sur le spectre des particules modifi´ees par la rhodamine tandis qu’il n’est pas retrouv´e sur les particules seules. Cela d´emontre que la rhodamine a ´et´e incorpor´ee aux nanoparticules.

400 450 500 550 600 650 700 Longueur d'onde (nm) A b sor b anc e MSNs MSNs-Rh RIBTC-APTES 10 100 1000 Int ens it é (u.a .) Taille hydrodynamique (nm) (a) (b)

FIGURE 3.36 : Spectre UV-Visible de la RBITC-APTES, des particules seules et des particules modifi´ees par la rhodamine (a). Les spectres UV-Visibles ont ´et´e r´ealis´es dans l’´ethanol. Distribution de taille DDL en intensit´e et clich´e MET des particules modifi´ees par la rhodamine apr`es extraction (b). Sel de fond : NaCl 10-3 M.

Apr`es extraction, les particules ont ´et´e caract´eris´ees par DRX et par sorption de N2. L’allure de l’isotherme (non montr´ee) correspond `a celle trouv´ee pour les mat´eriaux de type MCM-41 avec une marche correspondant `a la condensation capillaire caract´eristique de la m´esoporosit´e aux environs des pressions relatives P/P0 = 0,35. La surface sp´ecifique, le volume poreux et la taille des pores sont respectivement ´egales `a 1071 m2/g, 0,98 cm3/g et 2,8 nm. Le diffractogramme (non pr´esent´e) montre aussi les pics de r´eflexion caract´eristiques de l’arrangement hexagonal 2D. La distance centre `a centre a0 obtenue est ´egale `a 4,74 nm. La mesure du potentiel zˆeta

en fonction du pH (non pr´esent´ee) montre que la pr´esence de la rhodamine n’a pas d’influence sur les propri´et´es de surface des MSNs puisque l’allure obtenue est tr`es proche des MSNs non fonctionnalis´ees.

En revanche, la microscopie (Figure 3.36(b)) montre des particules bien dispers´ees dont la taille moyenne MET est ´egale `a 163 nm (cv = 0,29) mais aussi des agr´egats d’environ 700 nm. Les mesures de taille r´ealis´ees en diffusion de la lumi`ere corroborent ces r´esultats puisque deux distributions de taille sont observ´ees, une centr´ee `a 160 nm et une autre `a 600 nm.

3.4.2 Etude in vitro de la cytotoxicit´e des particules MSNs-Rh

Afin de v´erifier l’innocuit´e des MSNs-Rh vis-`a-vis des cellules tumorales, des tests de cytotoxicit´e ont ´et´e r´ealis´es. La pr´eparation de l’´echantillon et les conditions op´eratoires sont strictement les mˆemes que celles pr´esent´ees pour les MSNs fonctionnalis´ees (voir paragraphe 3.3.2). Les viabilit´es cellulaire des cellules SW480 en fonction de la concentration en MSNs-Rh pour les deux conditions de temps sont donn´ees sur la Figure 3.37.

0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 72 heures de traitement

72 heures de traitement + 3J post-incubation

Concentration MSNs-Rh (µg/mL) V ia b il it é c el lul ai re (%)

FIGURE 3.37 : Cytotoxicit´e des MSNs-Rh ´evalu´ee sur des cellules canc´ereuses de cˆolon humain SW480. La r´ev´elation est effectu´ee directement apr`es 72 heures de traitement ou apr`es 3 jours de post-incubation suppl´ementaires.

Les particules MSNs-Rh n’induisent aucun effet cytotoxique, et ce, quels que soient le temps de traitement et les concentrations utilis´ees. Les viabilit´es cellulaires sont toutes proches de 100%. Ces nanoparticules peuvent donc ˆetre utilis´ees afin d’´etudier l’internalisation des MSNs dans les cellules.